藍(lán)藻水華衍生的脅迫因子對(duì)枝角類生活史參數(shù)及抗氧化酶基因表達(dá)的影響.pdf

1、富營(yíng)養(yǎng)化最明顯的表征之一是暴發(fā)藍(lán)藻水華。藍(lán)藻水華大規(guī)模持續(xù)暴發(fā)會(huì)嚴(yán)重影響水質(zhì)和生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能，尤其在藍(lán)藻衰亡降解過(guò)程中，藻細(xì)胞死亡分解耗氧過(guò)多會(huì)導(dǎo)致需氧生物缺氧死亡，還會(huì)釋放有毒有害物質(zhì)，如藻毒素、含氮化合物等。為了探討藍(lán)藻水華降解過(guò)程中形成的脅迫因子對(duì)水體中主要浮游動(dòng)物類群枝角類的影響，本研究選擇太湖常見(jiàn)種擬同形溞(Daphnia similoides)、同形溞(Daphnia similis)和生態(tài)毒理檢測(cè)模式生物大型溞(Dap

2、hnia magna)為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)低溶氧、氨、微囊藻毒素和亞硝酸鹽對(duì)枝角類單一和復(fù)合暴露實(shí)驗(yàn)，研究水華衍生的脅迫因子對(duì)枝角類生活史參數(shù)及抗氧化酶基因表達(dá)的影響。主要結(jié)果如下:
　　1.在不同溶氧水平對(duì)D.similoides影響的21天慢性實(shí)驗(yàn)中，觀察了存活、生長(zhǎng)及繁殖方面的生活史參數(shù)變化。發(fā)現(xiàn)低溶氧會(huì)減少D.similoides的存活時(shí)間、蛻皮次數(shù)、阻礙生長(zhǎng)、推遲個(gè)體成熟和抑制繁殖，因此低溶解氧對(duì)D.similoides的生

3、活史參數(shù)具有顯著的負(fù)面效應(yīng)。利用直角曲線模型能較好地?cái)M合平均存活天數(shù)、蛻皮次數(shù)、繁殖窩數(shù)和總繁殖量隨著溶氧梯度的變化。通過(guò)該模型分別得到上述參數(shù)的EC50（半效應(yīng)濃度）分別為2.45、2.95、2.40、3.29 mg L-1，表明繁殖對(duì)低溶氧脅迫較敏感。由結(jié)果可推測(cè)，溶解氧的下降會(huì)對(duì)D.similoides種群產(chǎn)生不利的影響。
　　2.把D.similis暴露于不同濃度非離子氨和低溶氧復(fù)合條件下14天，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(1)低溶氧能減少

4、D.similis的存活天數(shù)和蛻皮次數(shù)，同時(shí)在低溶氧下0.48 mg L-1NH3顯著影響存活和蛻皮;(2)非離子氨能顯著推遲個(gè)體的性成熟時(shí)間并且抑制個(gè)體生長(zhǎng);(3)非離子氨和低溶氧都能抑制母體的繁殖能力，包括繁殖窩數(shù)、總繁殖量和平均繁殖量。因此，我們認(rèn)為非離子氨能協(xié)同低溶氧對(duì)枝角類D.similis的生活史參數(shù)起到復(fù)合抑制作用。
　　3.已報(bào)道的文獻(xiàn)認(rèn)為非離子氨，低溶氧，藻毒素等藍(lán)藻脅迫因子會(huì)破壞水生動(dòng)物物的抗氧化系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)根

5、據(jù)參照Tigriopus japonicas和Cherax quadricarinatusMn-SOD基因，設(shè)計(jì)引物克隆出D.magna Mn-SOD(Dm-Mn-SOD)基因，隨后研究了該基因在水華衍生脅迫因子藻毒素和亞硝酸鹽刺激下的表達(dá)模式。Dm-Mn-SOD cDNA全長(zhǎng)955 bp，含有一個(gè)完整的開放閱讀框，編碼的多肽由共編碼215個(gè)氨基酸，理論分子量為24594.24 kDa，等電點(diǎn)為7.10。利用MEGA5.03軟件對(duì)Dm-

6、Mn-SOD編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析計(jì)算遺傳距離，采用鄰接法構(gòu)樹，發(fā)現(xiàn)其與其他物種的線粒體Mn-SOD親緣關(guān)系最近，而且利用ClustalW同源比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)Dm-Mn-SOD與Dromia personata(75％)、Cancer pagurus(75％)和Carcinus maenas(75％)都具有相似的同源性。利用Real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)在藻毒素和亞硝酸鹽脅迫下的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)較低的亞硝酸鹽濃度和藻毒素都能上調(diào)Dm

7、-Mn-SOD基因的表達(dá)。線粒體是細(xì)胞中能量合成的場(chǎng)所，Dm-Mn-SOD基因在保護(hù)機(jī)體，尤其是清除線粒體內(nèi)的自由基起著重要作用，為維持細(xì)胞正常能量代謝提供保障。結(jié)合本研究基因表達(dá)的結(jié)果推測(cè)，亞硝酸鹽和藻毒素能造成機(jī)體氧化脅迫，機(jī)體為了清除線粒體內(nèi)過(guò)多的氧自由基，上調(diào)了Mn-SOD基因表達(dá)。
　　4.為了從基因表達(dá)水平研究藍(lán)藻水華衍生的脅迫因子對(duì)枝角類抗氧化酶系統(tǒng)的影響，本實(shí)驗(yàn)首先克隆出了水體污染物檢測(cè)常見(jiàn)模式生物D.magna的

8、Cu/Zn-SOD基因，隨后研究了該基因在藍(lán)藻水華衍生的兩種脅迫因子非離子氨和低溶氧刺激下的表達(dá)模式。該基因全長(zhǎng)eDNA序列已提交給GenBank，登錄號(hào)為JX456347。D.magna Cu/Zn-SOD(Dm-Cu/Zn-SOD) eDNA全長(zhǎng)537 bp，含有一個(gè)完整的開放閱讀框，編碼的多肽由共編碼178個(gè)氨基酸，理論分子量為16.11 kDa，等電點(diǎn)為5.84。該多肽含有一個(gè)由21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，表明它是胞外Cu/Zn-

9、SOD。通過(guò)多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該多肽有兩個(gè)Cu/Zn結(jié)構(gòu)域，各有四個(gè)Cu2+和Zn2+結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Dm-Cu/Zn-SOD與Daphniapulex(88％)、Alvinella pompejana(56％)和Cristaria plicata(56％)具有較高的同源性。利用Real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)Dm-Cu/Zn-SOD在非離子氨和低溶氧脅迫下的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)較低的非離子氨濃度和低溶氧都能誘導(dǎo)Dm-Cu/Z

10、n-SOD基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，Dm-Cu/Zn-SOD是良好的水域毒理檢測(cè)生物標(biāo)記物，同時(shí)也為進(jìn)一步研究枝角類抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)機(jī)制提供了基礎(chǔ)。
　　5.在藍(lán)藻水華積累及降解形成的低溶氧狀況下，枝角類的生長(zhǎng)和繁殖受到不同程度的抑制。為了解不同齡期（1、4、7、14天）D.magna對(duì)溶解氧急劇變化的耐受性，本研究采用急性毒性實(shí)驗(yàn)方法探討了低溶氧對(duì)不同齡期D.magna經(jīng)48小時(shí)暴露后存活情況。同時(shí)，檢測(cè)D.magna體內(nèi)hemo

11、globin(DHB)、α-esterase(EST)、catalase(CAT)、heat-shock protein70(HSP70)基因受到不同低溶氧脅迫的差異表達(dá)。(1)溶氧對(duì)不同齡期D.magna48小時(shí)存活率影響，結(jié)果表明日齡期越大的個(gè)體，對(duì)低溶氧脅迫越敏感，存活率越低，這可能是由于大齡個(gè)體所需的氧氣量要比低齡個(gè)體多造成的;(2)不同齡期個(gè)體的DHB對(duì)溶氧變化的響應(yīng)模式是相似的:隨著溶氧降低呈顯著性(p＜0.05)“先升后降

12、”趨勢(shì)。DHB具有結(jié)合氧氣分子并輸送到機(jī)體全身的功能，一般情況下，外界溶解氧下降會(huì)刺激血球蛋白基因表達(dá)量上升，但溶解氧過(guò)度下降會(huì)抑制血球蛋白表達(dá);(3)不同齡期個(gè)體的EST對(duì)溶氧變化的響應(yīng)模式是不同的:1日齡個(gè)體EST表達(dá)量隨著溶解氧下降而顯著性上升(p＜0.05）;4、7日齡個(gè)體EST表達(dá)量隨著溶解氧下降呈“先升后降”趨勢(shì)(p＜0.05);14日齡個(gè)體EST表達(dá)量隨著溶解氧下降呈顯著性下降(p＜0.05);(4)不同齡期個(gè)體的CAT和