棉鈴蟲中腸cDNA文庫的構(gòu)建、V-ATP酶亞基B基因的克隆與功能研究.pdf

1、昆蟲中腸是蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis(Bt)發(fā)揮作用的主要部位,Bt毒素與昆蟲中腸受體的結(jié)合是毒素發(fā)揮作用所必需的,中腸受體的變化被認(rèn)為是昆蟲產(chǎn)生抗性的主要機(jī)制。隨著Bt棉的大面積推廣,棉鈴蟲Helicoverpa armigera對(duì)Bt毒素產(chǎn)生的抗性將會(huì)嚴(yán)重威脅Bt棉長(zhǎng)期有效地利用,所以了解Bt抗性的分子機(jī)制是非常重要的。為了進(jìn)一步明確棉鈴蟲對(duì)Bt產(chǎn)生抗性的機(jī)制,為制定抗性治理策略和延長(zhǎng)Bt棉的使用壽命

2、提供重要的理論依據(jù),我們構(gòu)建了棉鈴蟲中腸的cDNA文庫；而且通過對(duì)文庫的篩選,我們發(fā)現(xiàn)了很多Vacuolar ATP酶亞基基因；因?yàn)橐延袌?bào)道Vacuolar ATP酶B亞基可能是Bt毒素CrylAc的結(jié)合蛋白,因此我們又克隆了棉鈴蟲中腸的V-ATP酶亞基B基因,并對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究。主要結(jié)果如下:
　　 1、運(yùn)用RNA轉(zhuǎn)錄過程中的5’末端轉(zhuǎn)換機(jī)制(Switching Mechanism at5’end of the RNAT

3、ranscript,SMART)技術(shù)構(gòu)建了棉鈴蟲中腸的cDNA文庫。對(duì)該文庫質(zhì)量分析表明:庫容量為2×106pfu／mL,重組率為100％,平均插入片段大于1kb,全長(zhǎng)率為50％,最終成功得到1098條表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags,ESTs)序列,文庫的各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到要求。
　　 2、利用兼并引物PCR結(jié)合RACE末端特異性擴(kuò)增技術(shù),克隆了棉鈴蟲中腸V-ATP酶基因的cDNA序列。該cDNA序列長(zhǎng)

4、2091bp,開放閱讀框?yàn)?485bp,編碼494個(gè)氨基酸,GenBank登錄號(hào)為GU370066。預(yù)測(cè)其分子量和等電點(diǎn)分別為55kD和5.26。軟件分析表明,V-ATP酶亞基B沒有信號(hào)肽,也沒有發(fā)現(xiàn)潛在的C端GPI錨定位點(diǎn)。序列同源性分析發(fā)現(xiàn),該序列與煙芽夜蛾的同源性最高,達(dá)99.8％；與人和小鼠相比同源性也很高,分別達(dá)85.2％和81.3％。說明V-ATPase亞基B基因非常保守。
　　 3、將V-ATPase亞基B基因進(jìn)行

5、了原核表達(dá),將表達(dá)的蛋白分別與Cry1Ac、Cry2Ab、Cry1C、Cry1B毒素進(jìn)行Ligand blot試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)蛋白可以與Cry1Ac、Cry2Ab、Cry1C毒素結(jié)合,而不能與Cry1B結(jié)合。證明V-ATPase亞基B基因是部分Bt毒素的結(jié)合蛋白。用表達(dá)蛋白與Cry1Ac毒素混合后飼喂棉鈴蟲幼蟲,生物學(xué)測(cè)定結(jié)果表明,與單獨(dú)取食Cry1Ac毒素的棉鈴蟲相比,取食含有V-ATP酶亞基B表達(dá)蛋白與Cry1Ac毒素混合液的幼蟲

6、體重差異不明顯。因此,雖然V-ATP酶亞基B基因是Cry1Ac等毒素的結(jié)合蛋白,但原核表達(dá)后的蛋白對(duì)Cry1Ac的毒力效果并沒有明顯影響。
　　 4、熒光定量PCR結(jié)果表明,不同發(fā)育時(shí)期V-ATP酶亞基B基因的表達(dá)量不同,成蟲的表達(dá)量最高,其次是幼蟲,在蛹中的表達(dá)量最低。在腸道不同部位的的表達(dá)量也有一定的差異,前腸與中腸表達(dá)量的差異不顯著,但明顯比后腸的表達(dá)量高。不同品系V-ATP酶亞基B基因的表達(dá)量差異較大,敏感品系的表達(dá)量明