縫隙連接蛋白與動脈粥樣硬化性腦梗死的相關性研究.pdf

1、目前,腦卒中是嚴重危害人類健康的常見病、多發(fā)病,具有發(fā)病率高、致殘率高及死亡率高的特點。其中腦梗死占全部腦卒中的60％-80％,而動脈粥樣硬化是引起腦梗死的最主要原因的之一。動脈粥樣硬化斑塊表面的纖維帽或是內(nèi)膜損傷導致斑塊破裂從而發(fā)生嚴重的并發(fā)癥如腦梗死等。因此對AS發(fā)病機理進行研究并對高危人群采取適當?shù)母深A措施,將有助于減少動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生。
　　 近幾十年來人們致力于研究動脈粥樣硬化的發(fā)病機制,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其與炎癥、高

2、血脂等多種因素相關,但其具體作用機制仍不甚明確。血管壁由內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞以及基質(zhì)等組成,這些成分組成一個統(tǒng)一體,但若要具有相應的功能則需相互間進行化學和電信號的交換。在這些信息通訊通路中,一個重要途徑就是縫隙連接通訊。縫隙連接是縫隙連接通訊的結構基礎,是由縫隙連接蛋白組成的細胞膜通道,允許離子、小的分子物質(zhì)以及第二信使在兩個相鄰細胞間進行交換。近年來人們發(fā)現(xiàn)縫隙連接與AS密切相關,但其作用機制尚不清楚。
　　 另外,最近對縫

3、隙連接蛋白37基因多態(tài)與AS及冠心病、心肌梗死之間進行了大量相關性研究,發(fā)現(xiàn)Cx37 C1019T位點是AS的“單基因標志物”,與冠心病、心肌梗死密切相關。而與冠心病和心肌梗死一樣以動脈粥樣硬化性為病理基礎的腦梗死是否與Cx37基因多態(tài)相關?目前國內(nèi)外尚未見報道。
　　 因此我們通過觀察氧化型低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和縫隙連接抑制劑辛醇對人臍靜脈內(nèi)皮細胞縫隙連接蛋白表達的影響,從細胞水平研究縫隙連接與AS的關系,并進一步探討其

4、中的機制。另外還在基因水平研究了Cx37基因多態(tài)和動脈粥樣硬化性腦梗死的相關性。
　　 第一部分 OX-LDL、HDL、辛醇octanol對人血管內(nèi)皮細胞縫隙連接蛋白和細胞凋亡的影響
　　 目的:體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞株HUVE-12,用ox-LDL誘導內(nèi)皮細胞損傷,建立動脈粥樣硬化損傷內(nèi)皮細胞模型,觀察其對內(nèi)皮細胞縫隙連接蛋白表達、細胞凋亡和線粒體凋亡途徑的影響,同時用HDL或octanol和ox-LDL共孵育對內(nèi)皮

5、細胞Cx表達和細胞凋亡的影響并探討其機制。
　　 方法:無菌培養(yǎng)HUVE-12,實驗分為7組:①對照組:普通DMEM培養(yǎng)基;②～④ox-LDL組:培養(yǎng)基中分別加入終濃度為25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml ox-LDL孵育24小時;⑤HDL組:培養(yǎng)基中加入終濃度為10μg/mlHDL孵育24小時;⑥HDL+ox-LDL組:培養(yǎng)基中加入終濃度為100μg/mlHDL和50μg/ml ox-LDL共同孵育24小時;⑦o

6、ctanol+ox-LDL組:培養(yǎng)基中加入終濃度為1mM octanol和50μg/mlox-LDL共同孵育24小時。分別用免疫細胞化學方法(Immunocytochemistry,ICC)、western blot方法和實時熒光定量RT-PCR(real-time fluorescent quantitative RT-PCR)檢測各組細胞縫隙連接蛋白Cx37、Cx40和Cx43以及Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白和相應mR

7、NA的表達;MTT方法檢測細胞增殖,臺盼藍拒染法檢測細胞活性和存活率,流式細胞儀檢測細胞凋亡。
　　 結果:1、與對照組比較,25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml ox-LDL組內(nèi)皮細胞上縫隙連接蛋白Cx37、Cx40蛋白和mRNA的表達水平下調(diào),Cx43蛋白和mRNA表達水平上調(diào),其差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同時25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml ox-LDL組細胞增殖受到明顯抑制,細胞凋

8、亡率顯著增加,細胞存活率下降,與對照組比較,其差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml ox-LDL組線粒體凋亡途徑的抑凋亡基因Bcl-2蛋白和mRNA表達水平下調(diào),促凋亡基因Bax和凋亡蛋白caspase-3蛋白及mRNA表達水平上調(diào),Bcl-2/Bax比值增大,與對照組比較,其差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2、與對照組比較,HDL組Cx37、Cx40蛋白和mRNA表

9、達水平均上調(diào),Cx43 mRNA表達水平下調(diào),其差異均具統(tǒng)計學意義(P＜0.05);HDL組明顯促進細胞增殖,細胞凋亡率顯著下降,細胞存活率增加,與對照組比較,其差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);線粒體凋亡途徑的抑凋亡基因Bcl-2蛋白和mRNA表達水平下調(diào),促凋亡基因Bax和凋亡蛋白caspase-3蛋白及mRNA表達水平上調(diào),Bcl-2/Bax比值增大,與對照組比較,其差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與50μg/ml ox-

10、LDL組比較,HDL+ox-LDL組Cx37、40蛋白和mRNA表達水平上調(diào),Cx43蛋白和mRNA表達水平下調(diào),其差異均具統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與50μg/ml ox-LDL組比較,HDL+ox-LDL組細胞增殖并未受抑制,細胞凋亡率下降,細胞存活率增加,其差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);線粒體凋亡途徑的抑凋亡基因Bcl-2蛋白和mRNA表達水平上調(diào),促凋亡基因Bax蛋白和mRNA表達水平下調(diào),凋亡蛋白caspase-3

11、mRNA表達水平下調(diào),Bcl-2/Bax比值增大,與50μg/ml ox-LDL組比較,其差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3、與50μg/ml ox-LDL組比較,octanol+ox-LDL組Cx37、Cx40蛋白和mRNA表達水平上調(diào),Cx43蛋白和mRNA表達水平下調(diào),其差異均具統(tǒng)計學意義(P＜0.05);octanol+ox-LDL組細胞增殖抑制率下降,細胞凋亡率下降,細胞存活率增加,與50μg/ml ox-

12、LDL組比較,其差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);線粒體凋亡途徑的抑凋亡基因Bcl-2蛋白和mRNA表達水平上調(diào),促凋亡基因Bax、凋亡蛋白caspase-3蛋白和mRNA表達水平下調(diào),Bcl-2/Bax比值增大,與500μg/ml ox-LDL組比較,其差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論:1、ox-LDL可以影響人臍靜脈內(nèi)皮細胞Cx蛋白及mRNA表達,且呈劑量依賴性,表明ox-LDL可能通過內(nèi)皮細胞Cx的重構

13、參與AS的發(fā)生和發(fā)展。Ox-LDL能明顯抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖并促其凋亡,且這種作用與濃度相關;其作用機理可能與線粒體凋亡途徑Bcl-2\Bax\Caspase-3有關,ox-LDL可能通過線粒體凋亡途徑導致細胞凋亡而參與AS的發(fā)生和發(fā)展過程。
　　 2、HDL能逆轉ox-LDL對內(nèi)皮細胞縫隙連接蛋白和線粒體凋亡途徑的影響。HDL和ox-LDL在AS中起相反的作用可能與其通過縫隙連接蛋白對線粒體凋亡途徑產(chǎn)生不同的影響有關。

14、r>　　 3、縫隙連接抑制劑octanol可逆轉ox-LDL對人臍靜脈內(nèi)皮細胞縫隙連接蛋白及mRNA的表達水平的影響,阻斷縫隙連接后可以抑制OX-LDL對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖抑制和促凋亡作用,且這種作用可能與線粒體凋亡途徑的Bcl-2\Bax\Caspase-3有關。Ox-LDL可能通過縫隙連接介導線粒體凋亡途徑導致細胞凋亡,促進AS的形成和發(fā)展。
　　 第二部分縫隙連接蛋白Cx37基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死的相關性研究

15、
　　 目的：探討Cx37 C1019T和I1297D基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病的相關性。
　　 方法：通過病例一對照研究設計,采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragmentlength polymorphism,PCR-RFLP)方法檢測145例健康對照組人群、245例動脈粥樣硬化性腦梗死(atherothrombitic

16、 cerebralinfarction,ACI)患者Cx37基因C1019T和I1297D位點的單核苷酸多態(tài)性。
　　 結果：1、湖南漢族人群中存在Cx37 C1019T和I1297D基因多態(tài)位點,對照組人群中,Cx37 C1019T三種基因型CC、CT和TT頻率分別是63.3％、29.0％和9.7％,C和T等位基因頻率分別是77.9％和22.1％;Cx37I1297D三種基因型II、ID和DD頻率分別是47.7％,42.6％和

17、9.7％,I和D等位基因頻率分別是69.0％和31.0％。
　　 2、Cx37 C1019T在ACI組三種基因型CC、CT和TT頻率分別是70.6％,25.7％和3.7％,C和T等位基因頻率分別是83.5％和16.5％,與對照組比較,兩組基因型頻率和等位基因頻率無顯著性差異(x2=3.765,P=0.152和x2=3.692,P=0.055)。ACI組Cx37 I1297D三種基因型II、ID和DD頻率是45.3％,42.9％和