WNK1激酶對鈣激活鉀通道的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究.pdf

1、WNK激酶(withnolysine(K)kinase)是一類新發(fā)現(xiàn)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，因其家族成員在激酶功能領(lǐng)域缺乏與ATP結(jié)合的賴氨酸而得名。迄今，在人類共發(fā)現(xiàn)了該家族的4個成員，即WNK1，WNK2，WNK3和WNK4。其中WNK1有兩種類型，全長WNK1（full-lengthWNK1，L-WNK1，簡稱WNK1）和腎臟特異性WNK1(kidneyspecificWNK1，KS-WNK1)。據(jù)研究WNK激酶家族的兩個成員W

2、NK1和WNK4的突變能導(dǎo)致一種少見的常染色體顯性遺傳性疾病——假性醛固酮減少征Ⅱ型(PseudohypoaldosteronismⅡ，PHAⅡ)，又稱為Gordon綜合征，臨床上表現(xiàn)為高血壓、高鉀血癥、高氯血癥、代謝性酸中毒和正常的腎小球?yàn)V過率。許多研究提示，WNK激酶構(gòu)成了一種新的信號通路，它們是腎臟中多個離子轉(zhuǎn)運(yùn)體和通道的上游調(diào)控蛋白，在維持腎臟電解質(zhì)平衡以及血壓調(diào)控中起非常重要的作用。新近的研究發(fā)現(xiàn)鈣激活鉀通道（CalciumA

3、cti-vatedPotassiumChannel），又可稱為MaxiK，BK通道或Slol，與高血壓有著不容忽視的聯(lián)系。MaxiK由Slol基因編碼，廣泛分布于心肌以外的各種不同組織中如腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)，在平滑肌上分布尤為豐富。在生理?xiàng)l件下，MaxiK持續(xù)激活并作為超極化因素以減少電壓依賴的鈣離子內(nèi)流，在維持血管平滑肌細(xì)胞(SMC)靜息膜電位上起著重要作用，MaxiK被阻斷即可引起平滑肌收縮，進(jìn)而導(dǎo)致高血壓的產(chǎn)生。此外，近年來發(fā)現(xiàn)腎臟中

4、的MaxiK對調(diào)節(jié)血壓和水鹽代謝也起著非常重要的作用。目前的研究報道WNK1激酶對血壓及電解質(zhì)平衡的調(diào)控得益于它對多種離子通道和離子轉(zhuǎn)運(yùn)體如ROMK、ENaC、NCC及NKCC的調(diào)控。但WNK1對與高血壓密切相關(guān)的MaxiK是否有調(diào)節(jié)作用目前在國內(nèi)外尚未見報道。在上述研究成果的啟發(fā)下，本實(shí)驗(yàn)聚焦于和調(diào)節(jié)高血壓及維持電解質(zhì)平衡密切相關(guān)的兩個分子——WNK1和MaxiK。為探討其調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，我們將在HEK-293T細(xì)胞上具體研究L-WN

5、K1激酶對MaxiK的影響。
　　 目的：
　　 1．觀察L-WNK1對MaxiK通道在HEK-293T細(xì)胞上分布的影響。
　　 2．研究L-WNK1對MaxiK通道在HEK-293T細(xì)胞上總蛋白表達(dá)的影響。
　　 3．研究溶酶體抑制劑對L-WNK1介導(dǎo)的MaxiK通道在HEK-293T細(xì)胞中的蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)作用的影響。
　　 4．研究蛋白合成抑制劑對L-WNK1介導(dǎo)的MaxiK通道在HEK-293

6、T細(xì)胞中的蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)作用的影響。
　　 方法：
　　 1．應(yīng)用細(xì)胞免疫染色法及熒光顯微鏡觀察止常情況下MaxiK在HEK-293T細(xì)胞上的分布，以及L-WNK1對MaxiK在HEK-293T細(xì)胞上分布的影響。
　　 2．應(yīng)用WesternBlot方法檢測L-WNK1對MaxiK在HEK-293T細(xì)胞中總蛋白表達(dá)水平的影響。
　　 3．利用質(zhì)子泵抑制劑BafilomycinA1(BafA1)阻斷溶酶體的降

7、解通路，應(yīng)用WesternBlot方法檢測L-WNK1激酶對MaxiK通道的蛋白調(diào)節(jié)作用是否通過降解途徑。
　　 4．利用蛋白合成抑制劑Cycloheximide(CHX)阻斷蛋白合成通路，應(yīng)用WesternBlot方法檢測L-WNK1激酶對MaxiK通道的蛋白調(diào)節(jié)作用是否通過合成途徑。
　　 結(jié)果：
　　 1．通過免疫熒光染色方法和熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與Vector對照組相比，LWNK1組中MaxiK在HEK-

8、293T細(xì)胞上分布明顯增多。
　　 2．WesternBlot方法提示，與Vector對照組相比，L-WNK1組MaxiK的總蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，且隨著L-WNK1的DNA量逐漸增加，上調(diào)作用逐漸增加，顯示其上調(diào)作用為劑量依賴性。
　　 3．通過使用BafA1阻斷溶酶體的降解通路，Vector對照組(100％)加用BafA1后MaxiK的總蛋白表達(dá)水平顯著增加(193.3±16.1％，P＜0.01，n=3)：L-WNK

9、1實(shí)驗(yàn)組(240.3±38％)加用BafA1后MaxiK的總蛋白表達(dá)水平無明顯升高(276.9±31.9％，P＞0.05，n=3)。
　　 4．通過使用CHX阻斷蛋白合成通路，對照組和實(shí)驗(yàn)組均以恢復(fù)DMEM培養(yǎng)液0小時為對照(100％)，恢復(fù)DMEM培養(yǎng)液4h后，Vector對照組MaxiK的總蛋白表達(dá)水平明顯升高(387.2±35.6％，P＜0.01，n=3)，L-WNK1實(shí)驗(yàn)組MaxiK的總蛋白表達(dá)水平明顯升高(674.3％

10、±35.6％，P＜0.01，n=3)：恢復(fù)DMEM培養(yǎng)液48h后，Vector對照組MaxiK的總蛋白表達(dá)水平明顯升高(165.5±26％，P＜0.01，n=3)，實(shí)驗(yàn)組MaxiK的總蛋白表達(dá)水平明顯升高(406.5±75.7％，P＜0.01，n=3)。提示利用蛋白合成抑制劑后實(shí)驗(yàn)組MaxiK的總蛋白水平回升幅度比對照組明顯。
　　 結(jié)論：
　　 1．L-WNK1激酶能增加MaxiK在HEK-293T細(xì)胞上的分布。