HMGB1-PTEN信號對膿毒癥肺損傷調(diào)節(jié)性T細胞的影響及機制.pdf

1、評論：
　　本研究的必要性：
　　膿毒癥系嚴重感染引起的系統(tǒng)性炎性反應綜合征（SIRS）,可導致多器官功能障礙或衰竭。調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)對炎性反應具有重要的負反饋調(diào)控作用，可減輕肺損傷。盡管針對Treg已開展了大量的研究，但是膿毒癥誘導的肺損傷過程中HMGB1-PTEN信號對Treg活化的調(diào)控機制目前國內(nèi)外尚無報道。
　　本研究的創(chuàng)新點及重要意義：
　　我們率先提出并初步驗證了巨噬細胞上 HMGB1-PTE

2、N軸在肺的炎性反應過程中對調(diào)控Treg具有重要作用HMGB1-PTEN是調(diào)控Treg水平的一條重要的信號轉導途徑，針對這一機制開展的初步探討可能為ARDS的防治提供了一條潛在的治療途徑。
　　背景：
　　膿毒癥由嚴重感染引起,是ICU患者高死亡率的主要原因。急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）系臨床膿毒癥患者中的常見并發(fā)癥，同時也是導致膿毒癥患者死亡率增高的重

3、要原因。盡管藥物研究取得很大的進展，但療效甚微，這也提示膿毒癥誘導炎性反應中的分子機制的復雜性，尚有很多未知亟需進行深入探討。脂多糖（LPS）刺激巨噬細胞,經(jīng) TNF-α或IL-1β介導導致高遷移率族 B1(HMGB1)的大量釋放，而利用特異性的抗體阻斷HMGB1可明顯減輕LPS引起的損傷。最新的研究顯示，HMGB1在觸發(fā)先天及特異性免疫反應中扮演重要角色，被認為是一種警示信號（alarmin），
　　最近有報道Treg對免疫介導

4、的炎性反應具有重要作用，對LPS引起的肺損傷具有保護作用。動物研究證明PTEN活性的增強可以減少 CD4+CD25+Tregs的產(chǎn)生且導致生存率下降，T細胞上的PTEN基因缺陷可以促進IL-2受體介導的CD4+CD25+Tregs增加,因此PTEN可能是維持Treg穩(wěn)態(tài)的一種重要的調(diào)節(jié)子。PTEN的缺乏可引起細胞核內(nèi)β-catenin的積聚，而敲除PTEN基因可增強P13K的表達，并減輕了由細菌感染引起的巨噬細胞的炎性反應和急性肺損傷的

5、程度。因此，β-catenin/PDK1/Akt信號通路可能在炎性反應過程中具有調(diào)控Treg產(chǎn)生的重要作用。盡管這方面已進行了相關的研究，但是位于巨噬細胞（先天免疫反應中的主要效應細胞）上的HMGB1-PTEN信號軸在膿毒癥（sepsis）引起的急性肺損傷過程中，對Treg的分化是否具有調(diào)控作用以及具體分子機制的研究，目前國內(nèi)外尚無報道，HMGB1在膿毒癥性肺損傷過程中究竟如何介導了免疫反應的分子機制也仍未明確。因此亟需進行研究。

6、>　　目的：
　　探討HMGB1-PTEN信號對CD4+CD25+FOXP3+Treg的調(diào)節(jié)作用及其分子機制，有望為ARDS的機制研究提供新線索，進而為ARDS的防治提供一條新途徑。
　　方法：
　　本項目擬臨床觀察結合動物實驗，采用實時RT-PCR、凝膠電泳遷移率（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）、Western Blot、基因沉默等分子生物學技術，從不同層次探討A

7、LI中HMGB1對CD4+CD25+Tregs分化及免疫狀態(tài)的影響及其作用的關鍵受體和可能的信號轉導途徑，具體分為以下幾個部分：
　　(1)HMGB1對膿毒癥引起的ARDS患者Treg水平的影響:分別檢測膿毒癥引起的ARDS患者及健康體檢人群的外周血中HMGB1濃度及CD4+CD25+CD127low的水平，進行二者之間的相關性分析。
　　(2)建立LPS誘導急性肺損傷的的小鼠模型：采用野生型及特定髓系PTEN基因敲除的小鼠

8、，分別腹腔注射LPS及重組HMGB1（rHMGB1）誘導小鼠的肺損傷模型，觀察并評價肺損傷程度
　　(3)進一步檢測HMGB1、TGF-β、TNF-α、IL-17A、IL-23(p-19)及Treg的水平，分析 HMGB1對TGF-β、TNF-α、 IL-17A、IL-23分泌的影響。
　　（4）分別檢測巨噬細胞及T淋巴細胞上的HMGB1、PTEN、β-catenin、PDK1和Akt的蛋白表達，分析HMGB1對 PTEN活

9、性、Tregs分化的影響，探討HMGB1/PTEN信號在HMGB1誘導小鼠肺損傷中的轉導作用。
　?。?）觀察PTENM-KO對 HMGB1介導ALI的保護作用。
　?。?）利用巨噬細胞與T細胞體外共培養(yǎng)技術，采用阻斷巨噬細胞HMGB1-PTEN信號的方法破壞HMGB1-PTEN軸，觀察阻斷HMGB1對TGF-β、Tregs和β-catenin/PDK1/Akt的影響。
　　（7） PTENM-KO對TGF-β、Tre

10、gs和β-catenin/PDK1/Akt信號轉導的影響，確定HMGB1-PTEN信號的調(diào)節(jié)作用并分析其作用的具體信號轉導機制。
　　結果：
　　（1）與健康對照組相比，膿毒癥誘導的ARDS患者血漿中HMGB1的水平明顯升高，而Treg水平明顯下降，且二者之間呈負相關。（2）通過阻斷HMGB1或在髓系上特異性敲除了PTEN基因進行干預，明顯減低了LPS或rHMGB1誘發(fā)的肺損傷的程度，同時TGF-β的水平明顯增加，促進了β-

11、catenin/PDK1/Akt信號傳導，以及Treg水平的提高。（3）體外細胞培養(yǎng)實驗進一步證實：阻斷HMGB1-PTEN信號導致CD4+CD25+Foxp3+Treg水平明顯增高。
　　結論：
　　臨床研究顯示：在膿毒癥引起的ARDS患者中，外周血HMGB1的升高與Treg水平的下降呈明顯相關性。在對LPS或rHMGB1處理后的小鼠體內(nèi)外的研究中，我們進一步發(fā)現(xiàn)：HMGB1可以觸發(fā)髓系上的PTEN介導的先天免疫反應。髓系