胸腺肽α1對膿毒癥小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的干預(yù)效應(yīng).pdf

1、目的：
　　 本實驗采用膿毒癥的動物模型觀察膿毒癥病理狀態(tài)下CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞變化的特點及其與膿毒癥嚴重程度間的關(guān)系；觀察胸腺肽α1干預(yù)對動物模型血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞變化的影響，研究胸腺肽α1對血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的干預(yù)效應(yīng)，探討胸腺肽α1作用于調(diào)節(jié)性T細胞的可能機制，探索以調(diào)節(jié)性T細胞為靶點的免疫調(diào)理方法治療膿毒癥免疫紊亂新手段。
　　 方法：
　　 1.用盲腸結(jié)扎穿孔法（

2、CLP）建立膿毒癥小鼠模型：先期進行預(yù)實驗，在保持對盲腸兩次穿孔的基礎(chǔ)上，通過改變結(jié)扎遠端盲腸的長度比例，調(diào)整模型膿毒癥的嚴重程度，以保持相對穩(wěn)定的病死率；記錄術(shù)后小鼠活動與進食飲情況、外觀變化、72h 生存情況等，并根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果對手術(shù)方法進行修正，保持72h 模型的生存率約為50％，從而保證膿毒癥模型的穩(wěn)定性；
　　 2.SPF級KM （昆明）小鼠，體重25～35g，用隨機數(shù)字表法將小鼠隨機分為假手術(shù)對照組（Sham組）、盲

3、腸結(jié)扎穿孔組（CLP組）和盲腸結(jié)扎后胸腺肽α1干預(yù)組（THI組）。各組按擬定時間點再隨機分為6個亞組，即術(shù)后2h、6h、12h、24h、48h和72h 亞組，每個亞組動物數(shù)為10～20只；各亞組于術(shù)后預(yù)定時間點對動物進行經(jīng)股靜脈切開放血至死亡，收集血、肝、肺、脾及回腸末端等標本；
　　 3.流式細胞術(shù)檢測各亞組小鼠血CD4+CD25+細胞與CD4+CD25-T細胞計數(shù)、CD4+CD25+/CD4+、 CD4+CD25+Foxp3

4、＋/ CD4+等細胞數(shù)量變化；流式細胞術(shù)檢測CD4+CD25+T細胞凋亡率；
　　 4.酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測小鼠血清IL-2、IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-10等細胞因子變化；
　　 5. 全自動生化檢測儀檢測肝和腎功能血生化指標；
　　 6. HE 染色觀察肺、肝、回腸末端等組織形態(tài)學(xué)改變；
　　 7. 記錄統(tǒng)計各組動物72h 生存率；
　　 8. 應(yīng)用Excel2003和

5、SPSS 統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，進行統(tǒng)計分析。結(jié)果1. 生存率通過手術(shù)方法的調(diào)整，用CLP 方法制作的KM小鼠膿毒癥動物模型，獲得了相對穩(wěn)定的生存率，72h 生存率為50％，符合實驗觀察與取材等時間要求。
　　 三組72h 生存率分別為：膿毒癥組45％，假手術(shù)組93.6％，胸腺肽干預(yù)組65％，膿毒癥與胸腺肽干預(yù)組比較有顯著差異，（χ2=5.558, P=0.0184）。
　　 2.流式細胞檢測
　　 1) CD4

6、+CD25+Foxp3+/CD4+：方差分析顯示術(shù)后各時間點三組間Treg 比例經(jīng)均有差異（P<0.05）；但Sham組組內(nèi)術(shù)后Treg 所占比例幾無變化，始終處于低水平；與CLP 比較，THI組各時間點上Treg 比例均顯著低于后者（P<0.05 或P<0.01），且CLP組術(shù)后Treg 比例持續(xù)大幅上升，遠高于術(shù)后初期水平（P<0.01）；
　　 Th組24h后略有升高，但幅度遠不及CLP組（P<0.05 或P<0.01）。

7、
　　 2) CD4+CD25+T細胞凋亡率：術(shù)后各時間點凋亡CD4+CD25+T細胞占CD4+CD25+T細胞總數(shù)的比例（凋亡率）組間比較有差異（P<0.05 或P<0.01）；THI組凋亡率升高最快并保持高于另兩組狀態(tài)（P<0.05 或P<0.01）；Sham組術(shù)后6～24h內(nèi)一度高于CLP組（P<0.01），但48h和72h時間點上又明顯降至CLP組之下（P<0.05 或P<0.01）。
　　 3.細胞因子所檢測的

8、幾種細胞因子濃度，Sham組均較另兩組低（P<0.01），THI組和CLP組術(shù)后IL-2 均先升后降，但CLP上升速率較Th組快（P<0.01），12h 達到峰值，THI組則24h 達到峰值，而THI組峰值明顯低于CLP組（P<0.01）；24h后血清IL-2水平下降，CLP組下降速率較THI組快，48h和72h時均明顯低于后者（P<0.01）。組間TNF-α水平術(shù)后2h 即有差異（P<0.01），CLP組最高，Sham組最低；三組術(shù)后

9、6～12h 均有一快速上升期，12h 達到峰值，隨后CLP組和Sham組迅速下降，而THI組保持相對緩降并居于另兩組之上。IL-10和TGF-β變化趨勢相似，Sham組低位波動，THI組和CLP組進行性增高，但THI組顯著低于CLP組（P<0.01）。
　　 4.生化檢測CLP小鼠術(shù)后12h 之內(nèi)，肝腎功能生化指標與假手術(shù)組相比均無顯著改變(P>0.05)；隨后均出現(xiàn)顯著改變，表現(xiàn)為24h后肝功能的ALT、AST和48h后腎功能

10、的BUN與Cr值顯著高于假手術(shù)組（P<0.05，P<0.01），并呈進行性升高。
　　 5.組織形態(tài)學(xué)CLP 24h后腹腔內(nèi)滲液增加且伴有惡臭、盲腸末端開始包裹，隨時間延長呈進行性加重。回腸組織表現(xiàn)為充血水腫、炎性細胞浸潤增多、粘膜脫落、出血形成膿腔等；Sham組僅腹腔少量滲出，回腸幾無病理改變；THI組也出現(xiàn)類似CLP組的病理改變，但對應(yīng)時間點上病理損害程度明顯比CLP組輕。
　　 結(jié)論：
　　 本實驗在建立了

11、穩(wěn)定的膿毒癥小鼠模型的基礎(chǔ)上對膿毒癥模型血中調(diào)節(jié)性T細胞的變化特點進行了觀察與分析，并以免疫調(diào)節(jié)劑—胸腺肽α1進行干預(yù)，了解膿毒癥模型調(diào)節(jié)性T細胞因胸腺肽α1干預(yù)而發(fā)生的變化，討論此干預(yù)效應(yīng)對膿毒癥病理生理發(fā)展所產(chǎn)生的影響。
　　 實驗結(jié)果表明：膿毒癥病理狀態(tài)下，血調(diào)節(jié)性T細胞所占比例有不斷增加的趨勢，而且病情越嚴重，CD4+CD25+Foxp3+所占比例就越高；與之相反，隨著病情的不斷進展，CD4+CD25+凋亡率越來越低。促

12、炎癥反應(yīng)因子TNF-α、IL-2 早期（6～24h）快速升高并達到峰值，隨后較快回落；抑制炎癥反應(yīng)因子TGF-β、IL-10則呈逐漸上升趨勢，并且病程中后期（24～72h）增幅明顯變大；胸腺肽α1干預(yù)條件下，CD4+CD25+Foxp3+所占比例的增加被抑制而CD4+CD25+凋亡率顯著升高；隨病病程的進展與加重，促炎癥反應(yīng)因子TNF-α、IL-2 早期升高的速率與峰值并未超越CLP組，但隨后回落速率明顯低于CLP組；抑制炎癥反應(yīng)因子T