膿毒癥調(diào)節(jié)性T細胞凋亡對效應T細胞免疫功能的影響及血必凈注射液的干預作用.pdf

1、目的：探討膿毒癥CD4+CD25+Treg凋亡對CD4+效應T細胞免疫功能的影響及血必凈注射液的干預作用。 方法： 1.體外實驗：斷頸處死Wister大鼠，無菌取脾臟，分離單個核細胞。 1)免疫磁珠法(MACS)分離正常大鼠脾臟CD4+T細胞、CD4+CD25-T細胞、及CD4+CD25+Treg，以異硫氰酸熒光素(FITC)標記CD25，流式細胞術(FCM)鑒定細胞純度，0.4％臺盼藍染色檢測細胞存活率。

2、 2)將體外分離的CD4+CD25+Treg分為對照組、抗-CD3/CD28刺激組、抗-CD3/CD28+脂多糖(LPS)刺激組、抗-CD3/CD28+LPS+血凈組(5mg/ml)、抗-CD3/CD28+血必凈組，于第3天以別藻藍蛋白(APC)標記Annexin-V及放線菌素D(7-AAD)標記Treg，F(xiàn)CM檢測細胞的凋亡率；藻紅蛋白熒光素(PE)標記表面標志物叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)和T淋巴細胞毒性相關抗原4(CTLA

3、-4)，F(xiàn)CM檢測Foxp3和CTLA-4平均熒光強度；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-10分泌情況。 3)將各組Treg分別與CD4+CD25T細胞1:1共培養(yǎng)，刀豆素(ConA)刺激68h，噻唑藍(MTT)比色分析法檢測T細胞增殖、ELISA法檢測白介素2(IL-2)和可溶性IL-2受體(sIL-2R)及輔助性T細胞(Th)漂移因子干擾素γ(INFγ)/IL-4/IL-17的分泌。 2.體內(nèi)實驗:復制盲腸結(jié)扎

4、并穿孔(CLP)大鼠膿毒癥模型，體外提取脾臟CD4+CD25+Treg培養(yǎng)過夜。 1)將大鼠分為對照組、假手術組、CLP組，血必凈組(4mg/kg)，于第3天檢測FOXP3、CTLA-4、凋亡率、IL-10。 2)將各組CD4+CD25+Treg與CD4+CD25-T細胞1:1共培養(yǎng)，ConA刺激68h，檢測T細胞增殖、IL-2/sIL-2R、INFγ/IL-4/IL-17。 結(jié)果： 1.體外實驗

5、 1)Treg凋亡：對照組凋亡率各時間點之間比較無統(tǒng)計學意義；抗-CD3/CD28單克隆抗體誘導Treg凋亡率明顯高于同時間對照組，達25-40％。Foxp3、CTLA-4與凋亡率呈負相關；抗-CD3/CD28+LPS刺激組凋亡率高于同時間對照組，稍低于抗-CD3/CD28刺激組，但無統(tǒng)計學意義，而Foxp3、CTLA-4與對照組比較并不隨凋亡率增加而降低。 2)對效應T細胞免疫功能的影響: ①T細胞增殖:正常Treg能明顯抑制

6、Teff增殖功能，抗-CD3/CD28組和anti-CD3/CD28+血必凈組明顯高于對照組，抗-CD3/CD28+LPS較對照組明顯降低，抗-CD3/CD28+LPS+血必凈組與抗-CD3/CD28+LPS組比較有明顯差異。②IL-2/sIL-2Ra的分泌:IL-2:抗-CD3/CD28刺激組較對照組明顯升高；抗-CD3/CD28+LPS刺激組明顯低于對照組和抗-CD3/CD28刺激組；抗-CD3/CD28+LPS+血必凈刺激組較對照

7、組、抗-CD3/CD28刺激組、抗-CD3/CD28+血必凈刺激組明顯降低，而較抗-CD3/CD28+LPS組升高。slL-2Ra:抗-CD3/CD28+LPS組較抗-CD3/CD28組有明顯升高，抗-CD3/CD28+LPS+血必凈組較抗-CD3/28+血必凈組有明顯升高。③Th1/Th2/Th17(IFNγ/IL-4/IL-17)漂移:INFγ和IL-4隨凋亡增加而升高，抗-CD3/CD28+LPS+血必凈組INFγ分泌明顯高于抗-

8、CD3/CD28+LPS組，而IL-4則呈相反變化，使IFNγ/IL-4升高；抗-CD3/CD28+血必凈組IL-17較抗-CD3/CD28組有明顯降低。 2.體內(nèi)實驗 1)Treg凋亡：結(jié)果表明對照組Treg凋亡率為12.03±0.89％，假手術組(9.48±2.17％)和對照組比較無明顯差異，CLP組凋亡率(5.87±0.44％)低于對照組，而血必凈治療組明顯高于其他各組。Foxp3、CTLA-4表達和IL-10分泌

9、功能隨凋亡率增加而減少，成負相關。 2)對效應T細胞免疫功能的影響：①T細胞增殖:MTT檢測Teff增殖顯示CLP組抑制率明顯高于對照組，而血必凈組抑制率低于CLP組和對照組。②IL-2/sIL-2Ra的分泌:CLP組IL-2分泌低于對照組，slL-2Ra高于對照組；血必凈組IL-2分泌高于CLP組，sIL-2Ra低于CLP組。③Th1/Th2/Th17(IFNγ/IL-4/ IL-17)漂移:CLP組INFγ、IL-4和IFN