p38MAPK在高血糖致大鼠微血管通透性增高過(guò)程中的作用.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模耗壳?，無(wú)論是1型還是2型糖尿病，高血糖的毒性作用已被公認(rèn)為是血管并發(fā)癥的主要致病因素。而在糖尿病病程發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，血管通透性的增高是糖尿病血管并發(fā)癥的一個(gè)標(biāo)志性事件，是其發(fā)生的最初表現(xiàn)和導(dǎo)致其他后續(xù)改變的病理基礎(chǔ)，所以研究高血糖致微血管通透性增高的機(jī)制就成為一個(gè)很有意義的工作。本課題以SD大鼠為研究對(duì)象，通過(guò)復(fù)制糖尿病模型，利用在體腸系膜微血管通透性的測(cè)定，腸系膜微血管骨架蛋白染色等手段，研究p38MAPK(p38mitog

2、en-activatedproteinkinase，p38MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)通路在糖尿病大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高中的作用機(jī)理。我們通過(guò)上述研究試圖闡明p38MAPK在高血糖致微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高過(guò)程中的作用，探討高血糖致微血管通透性增高的發(fā)生機(jī)制，并為糖尿病諸多慢性并發(fā)癥的診治提供新的思路和理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.實(shí)驗(yàn)分組 符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)的SPF級(jí)SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠60

3、只，體重180-200g，由第一軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。健康雄性SD大鼠隨機(jī)分成5組：(1)正常組(normal)：健康大鼠，與造模大鼠同條件下飼養(yǎng)。(2)糖尿病組(Diabetesmilltus，DM)：(3)溶劑對(duì)照組(control)：健康大鼠腹腔注射相同容量的STZ溶劑，與造模大鼠同條件下飼養(yǎng)。(4)DM+MKK6b(A)組：糖尿病模型大鼠實(shí)驗(yàn)前24h尾靜脈注射p38上游激酶MKK6b的無(wú)活性誘變體[MKK6b(A)]2.5m

4、l/kg。(5)MKK6b(E)組：與造模大鼠同條件下飼養(yǎng)健康大鼠，實(shí)驗(yàn)前24h尾靜脈注射p38上游激酶MKK6b的活性誘變體[MKK6b(E)]2.5ml/kg。 2.糖尿病大鼠模型的制備 健康雄性SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素55mg/kg，分別在72h、一個(gè)月斷尾尖采血檢測(cè)血糖，其值均大于16.7mmol/L為造模成功。血糖檢測(cè)用羅氏公司生產(chǎn)樂(lè)全康2血糖檢測(cè)儀及其配套的樂(lè)全康系列血糖試紙。 3.腸系膜微血管內(nèi)皮

5、細(xì)胞骨架蛋白的觀察 各組SD大鼠用0.5％戊巴比妥鈉6ml/kg麻醉，打開(kāi)腹腔，迅速取血管豐富段腸系膜，置于磷酸鹽緩沖液(PBS)，在立體顯微鏡下分離微靜脈，游離的微靜脈用PBS漂洗2min×3次，然后用4％甲醛溶液固定10min，PBS漂洗2min×3次，再用0.5％TritonX-100液處理15分鐘，PBS漂洗2min×3次，最后用2U/ml的羅丹明-鬼筆環(huán)肽室溫避光孵育1h，PBS漂洗2min×3次。染色結(jié)束后在激光共聚

6、焦顯微鏡下觀察并掃描記錄微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架圖片(放大1000倍，油鏡)。 4.在體大鼠腸系膜微血管通透性的檢測(cè) SD大鼠用05％戊巴比妥鈉6ml/kg麻醉后行股動(dòng)、靜脈插管術(shù)，其中動(dòng)脈插管連接電子血壓計(jì)，大鼠平均動(dòng)脈壓穩(wěn)定在105-125mmHg之間；剖腹并將腸系膜暴露于倒置熒光顯微鏡下，腸系膜局部溫度保持37℃。股靜脈注射5mg/L熒光標(biāo)記白蛋白(Albumin，F(xiàn)luoresceinisothiocyanate，F(xiàn)I

7、TC-albumin)50ml/kg，10min內(nèi)流經(jīng)或透出直徑為30±3μm的微靜脈血管熒光白蛋白的強(qiáng)度變化情況由攝像機(jī)記錄并輸入計(jì)算機(jī)存檔。用圖像分析軟件計(jì)算一定時(shí)間內(nèi)血管內(nèi)外熒光強(qiáng)度，而反映微血管通透性的Pa值用血管內(nèi)外熒光強(qiáng)度比值的變化速率來(lái)表示，每只大鼠測(cè)三次，取平均值。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.高血糖所致微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白的改變 正常組腸系膜微靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白染色結(jié)果顯示，F(xiàn)-actin主要分布在細(xì)胞

8、周邊，線條清晰完整連續(xù)，整根血管顯示出內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)。糖尿病組微血管的血管內(nèi)皮骨架形態(tài)不再完整，細(xì)胞骨架蛋白網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)已經(jīng)離散，提示高血糖時(shí)腸系膜微血管內(nèi)皮骨架形態(tài)發(fā)生的改變。 2.抑制p38MAPK激活后對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白的影響 p38上游激酶MKK6b的無(wú)活性誘變體MKK6b(A)處理糖尿病大鼠，抑制了p38MAPK的激活后，腸系膜微靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的骨架蛋白正常網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)。 3.直接激活p38M

9、APK激活后對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白的影響 p38上游激酶MKK6b的活性誘變體MKK6b(E)處理正常大鼠，直接激活了p38MAPK后，腸系膜微靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)基本消失，細(xì)胞骨架形態(tài)凌亂。 4.糖尿病大鼠血管通透性的改變和p38MAPK的作用 本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，糖尿病組大鼠腸系膜微血管通透性比正常組和溶劑組對(duì)照組都有了顯著性增高(p＜0.05)，用p38上游激酶MKK6b的活性誘變體MKK6b(E)處

10、理的MKK6b(E)組大鼠，腸系膜微靜脈通透性也是顯著增高(p＜0.05)，而用無(wú)活性誘變體MKK6b(A)處理的MKK6b(A)組大鼠比糖尿病組腸系膜微靜脈通透性明顯降低(p＜0.05)，而與正常組和溶劑對(duì)照組則都沒(méi)有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 1.高血糖可以使微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白發(fā)生形態(tài)學(xué)變化，并且可以導(dǎo)致微血管的通透性增高。 2.用MKK6b(E)直接激活p38MAPK信號(hào)通路可以使微

11、血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白形態(tài)學(xué)發(fā)生變化，并且能增高大鼠微血管的通透性。用MKK6b(A)抑制了p38MAPK信號(hào)通路可以改善高血糖所致微靜脈內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白改變，并能抑制高血糖所致微靜脈的高通透性。 3.糖尿病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，由于高血糖事件的發(fā)生，p38MAPK被激活，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，作用于細(xì)胞骨架蛋白，引起F—actin的重組和再分布，導(dǎo)致細(xì)胞骨架破壞，細(xì)胞間隙增大并影響細(xì)胞間連接的結(jié)構(gòu)和功能完整性，最終導(dǎo)致血管的