p115RhoGEF-RhoA信號通路參與調(diào)控LPS及TNF-α致腦微血管內(nèi)皮細胞通透性增高的機制研究.pdf

1、感染性腦損傷是兒科常見的危急重癥，雖然隨著高效抗生素的廣泛應用，近年死亡率有所下降，但其致殘率仍然很高，存活的患兒中約有30％-50％留有嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。感染性腦損傷時血腦屏障(blood-brainbarrier，BBB)通透性增高所致的顱高壓是其患者致死或致殘的主要原因之一。腦微血管內(nèi)皮細胞(brainmicrovascularendothelialcells，BMECs)及BMECs間的緊密連接(tightjunction，

2、TJ)是維持BBB結構和功能完整的主要成分及結構基礎。已有的研究發(fā)現(xiàn)多種因素參與了感染性腦損傷時BBB通透性增高的發(fā)生發(fā)展，涉及細菌毒素如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、細胞因子如腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)與BMECs的相互作用。目前對TJ的研究主要以肺微血管內(nèi)皮細胞或上皮細胞為對象，感染性腦損傷時LPS致BMECs通透性增高、BMECs-TJ改變及其調(diào)控機制的研究

3、較少。
　　 小分子G蛋白Rho(Rashomologous，Rho)屬于Ras超家族，包括Rho(RhoA、RhoB、RhoC)、Rac和Cdc42三個亞家族，在細胞骨架的相關活動如細胞遷移、軸突導向、細胞變形、收縮粘附等過程中發(fā)揮重要的作用。其中，RhoA、Rac1和Cdc42是研究最為深入的成員。RhoA通過其上游的鳥苷酸交換因子(guaninenucleotideexchangefactors，GEFs)與G蛋白耦聯(lián)受體

4、（GPCRs）密切聯(lián)系;RhoA下游的Rho激酶激活后可取代肌球蛋白輕鏈激酶(myosinlightchainkinase，MLCK)直接磷酸化肌球蛋白輕鏈(myosinlightchain，MLC)，提高肌球蛋白活性，使肌動-肌球蛋白交聯(lián)增加，導致細胞收縮，細胞間隙擴大。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，應用Rho激酶特異性抑制劑Y-27632可以部分抑制LPS誘導的體外BBB通透性增高，提示LPS可能通過RhoA信號途徑影響B(tài)BB通透性。因此

5、，研究LPS及TNF-α對BMECs的影響并探討其具體的調(diào)控機制，有助于了解感染性腦損傷時BBB通透性增高的病理過程，為其臨床防治提供新的思路。本研究分為三部分:
　　 第一部分LPS對原代大鼠BMECs通透性的影響及機制
　　 目的:探討LPS對大鼠BMECs通透性的影響及其可能的機制。
　　 方法:分離和培養(yǎng)原代大鼠BMECs，隨機分為對照組和LPS干預組。利用跨內(nèi)皮細胞電阻抗(transendothelia

6、lelectricalresistance，TEER)檢測BMECs通透性，pull-down法測定RhoA活性，Westernblot檢測p115RhoGEF和TJ蛋白ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表達變化。
　　 結果:與對照組(159.0±8.6Ω·cm2)比較，LPS作用3h時大鼠BMECs的TEER值明顯下降(108.3±4.21Ω·cm2)，作用12h時LPS干預組TEER達最低水平(85.4±2

7、.52Ω·cm2)。Pull-down法證實LPS作用5min后RhoA活性增高，15min達到高峰;Westernblot證實LPS作用1h后p115RhoGEF蛋白表達上調(diào)，3h達到高峰，12h降至正常水平;LPS作用3h后TJ蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的表達均有不同程度下降。
　　 結論:LPS導致BMECs通透性增高，其機制與TJ蛋白表達水平下降有關。p115RhoGEF/RhoA信號通路的活化可

8、能與此過程有關。
　　 第二部分p115RhoGEF/RhoA信號通路參與LPS致BMECs通透性增高的調(diào)控
　　 目的:探討p115RhoGEF/RhoA信號途徑參與LPS致BMECs通透性增高的調(diào)控機制。
　　 方法:(1)體外培養(yǎng)小鼠BMECs株（bEnd.3細胞），Westernblot檢測LPS刺激后不同時間點p115RhoGEF的表達水平;
　　 (2)合成p115RhoGEF小干擾RNA(s

9、iRNA)并轉染bEnd.3細胞，Westernblot鑒定siRNA對p115RhoGEF蛋白表達的抑制作用;
　　 (3)bEnd.3細胞轉染p115RhoGEF-siRNA或給予RhoA抑制劑C3轉移酶預處理，pull-down法檢測LPS刺激后RhoA活性變化，TEER檢測BMECs通透性改變，直接免疫熒光觀察纖維狀肌動蛋白(F-actin)變化，Westernblot檢測TJ蛋白ZO-1、occludin、claudi

10、n-5蛋白表達變化。
　　 結果:(1)LPS作用bEnd.3細胞1h后，p115RhoGEF蛋白表達水平上調(diào)，3h達到高峰;
　　 (2)轉染p115RhoGEF-siRNA的bEnd.3細胞p115RhoGEF蛋白表達較對照組明顯減少;
　　 (3)C3轉移酶組RhoA活性被完全抑制，LPS刺激后TEER值較對照組增高，ZO-1、occludin、claudin蛋白表達下降不明顯;與C3轉移酶組相比，抑制p1

11、15RhoGEF表達可部分抑制LPS誘導的RhoA活化、TEER下降及ZO-1表達減少;轉染p115RhoGEF-siRNA和C3轉移酶預處理可以減少LPS導致的F-actin重組。
　　 結論:成功構建p115RhoGEF-siRNA抑制bEnd.3的p115RhoGEF表達，證實p115RhoGEF/RhoA信號通路參與了LPS致BMECs通透性增高的調(diào)控。
　　 第三部分Rho信號通路與TNF-α致BMECs通透性

12、增高相關
　　 目的:證實Rho信號通路與TNF-α致BMECs通透性增高相關。
　　 方法:(1)以培養(yǎng)至融合的小鼠BMECs株（bEnd.3細胞）為實驗對象，Westernblot檢測RhoA總蛋白表達，pull-down法檢測TNF-α刺激后RhoA活性;
　　 (2)p115RhoGEF-siRNA轉染bEnd.3細胞，Westernblot鑒定轉染細胞中p115RhoGEF蛋白表達的抑制情況;
　

13、　 (3)p115RhoGEF-siRNA轉染bEnd.3細胞，pull-down法檢測TNF-α刺激后RhoA活性變化。
　　 (4)bEnd.3細胞隨機分為對照組、TNF-α干預組和Y-27632預處理組，觀察bEnd.3細胞TEER的變化。
　　 結果:RhoA活性在TNF-α刺激30min后明顯增高并達到高峰，RhoA總蛋白表達在TNF-α刺激12h和24h顯著上調(diào);TNF-α刺激30min，p115RhoGE