細(xì)胞骨架重構(gòu)在VEGF與TNF-α促進(jìn)漢坦病毒感染致血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高中的作用及其機(jī)制.pdf

1、漢坦病毒（hantanvirus）是腎綜合征出血熱（hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome,HFRS）和漢坦病毒肺綜合征（hantaviruspulmonarysyndrome,HPS）的病原體。致病性漢坦病毒感染人體后以毛細(xì)血管和小血管的內(nèi)皮細(xì)胞為主要靶細(xì)胞，在感染后數(shù)周內(nèi)引發(fā)以血管滲漏綜合征（vascularleakagesyndrome,CLS）和腎功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的臨床綜合征。目前血管內(nèi)皮細(xì)胞損

2、傷的機(jī)制研究主要包括病毒與其受體β3整合素結(jié)合后直接影響內(nèi)皮細(xì)胞功能致病學(xué)說和以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）、腫瘤壞死因子（TumorNecrosisFactor-α,TNF-α）等炎癥介質(zhì)升高和相關(guān)免疫細(xì)胞功能變化等免疫學(xué)致病學(xué)說。而具體機(jī)制有待深入研究。
　　細(xì)胞骨架重構(gòu)是調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮通透性升高的重要機(jī)制，而β3整合素和VEGF、TNF-α等均參與細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)。

3、所以本研究以漢灘病毒（hantaanvirus,HTNV，致病性漢坦病毒中的主要型別）和體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（humanumbilicalveinendothelialcell,HUVECs）為研究對(duì)象，以細(xì)胞骨架為切入點(diǎn)，研究細(xì)胞骨架重構(gòu)是否參與了漢坦病毒感染以及VEGF、TNF-α對(duì)體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響；觀察調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重構(gòu)的重要分子RhoA/Rock/p-MLC的變化，以及Rock激酶抑制劑Y27632能否阻斷

4、或部分阻斷血管內(nèi)皮通透性的變化。旨在探討漢坦病毒感染所致的血管內(nèi)皮高通透性的發(fā)病機(jī)理，并為下一步深入研究減輕細(xì)胞高通透性的藥物研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　主要研究方法和內(nèi)容
　　1.HTNV感染對(duì)HUVECs通透性影響
　　實(shí)驗(yàn)（一）首先擴(kuò)增并滴定HTNV76-118毒株并感染體外培養(yǎng)的HUVECs。運(yùn)用跨內(nèi)皮電阻測(cè)定（transepithelialelectricalresistance,TEER）、免疫熒光染色、流式細(xì)

5、胞術(shù)等技術(shù)觀察HTNV感染HUVECs不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供相關(guān)數(shù)據(jù)及操作經(jīng)驗(yàn)。
　　2.細(xì)胞骨架重構(gòu)在VEGF促進(jìn)HTNV感染致HUVECs高通透性中的作用及機(jī)制
　　實(shí)驗(yàn)（二）中以體外培養(yǎng)的HUVECs為對(duì)象，應(yīng)用粘附實(shí)驗(yàn)、Transwell技術(shù)及流式細(xì)胞技術(shù)，觀察VEGF對(duì)HTNV感染HUVECs的通透性、粘附能力和遷移能力的改變，分析β3與VEGFR2表達(dá)數(shù)量的變化；用熒光染色技術(shù)標(biāo)記顯示細(xì)

6、胞骨架的重構(gòu)；電子顯微鏡觀察細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)的變化；免疫蛋白印跡（western-blot）、逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）方法檢測(cè)β3-VEGFR2功能復(fù)合物下游參與細(xì)胞骨架重構(gòu)的重要分子RhoA/Rock激酶、磷酸化的肌球蛋白輕鏈（myosinlightchainphosphorylation,P-MLC）蛋白和mRNA水平上的變化。以上實(shí)驗(yàn)擬證實(shí)致病性漢坦病毒感染不僅影響β3整合素的功能，而且影響β3-VEGFR2復(fù)合物的功

7、能，這可能是HFRS病程中VEGF水平升高而加劇血管內(nèi)皮通透性的原因之一；RhoA/Rock/p-MLC分子通路參與的細(xì)胞骨架重構(gòu)可能是VEGF促進(jìn)HTNV感染HUVECs通透性升高的機(jī)制之一；Rock激酶的抑制劑Y27632可以部分阻斷或減弱VEGF促進(jìn)HTNV感染HUVECs高通透性的作用。
　　3.細(xì)胞骨架重構(gòu)在TNF-α致HTNV感染致HUVECs高通透性中的作用
　　既往研究顯示TNF-α的增高也參與了HFRS病程

8、血管通透性的調(diào)節(jié)。而細(xì)胞骨架重構(gòu)可能是TNF-α增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性的重要通路。
　　實(shí)驗(yàn)（三）采用內(nèi)皮細(xì)胞電阻儀、免疫熒光染色、western-blot、qRT-PCR、電子顯微鏡等與第二部分實(shí)驗(yàn)中類似的實(shí)驗(yàn)方法觀察TNF-α對(duì)HTNV感染的HUVECs通透性的作用，伴隨通透性改變的細(xì)胞骨架重構(gòu)情況、相鄰細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)的變化，RhoA/Rock/p-MLC等分子表達(dá)的變化；以及Y27632對(duì)上述作用有否影響。
　　主要結(jié)果

9、：
　　1.單純HTNV感染可以導(dǎo)致體外培養(yǎng)的HUVECs通透性升高。
　　2.VEGF可以明顯促進(jìn)HTNV感染HUVECs通透性的升高，并伴隨有β3整合素-VEGFR2復(fù)合體功能失調(diào)及細(xì)胞骨架的重構(gòu)。
　　3.RhoA/Rock/P-MLC分子通路可能參與VEGF介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重構(gòu)所致的通透性升高；Rock激酶抑制劑Y27632可以明顯減輕上述作用。
　　4.TNF-α可明顯促進(jìn)HTNV感染HUVECs通透性的

10、升高，并伴隨有細(xì)胞骨架的重構(gòu)。
　　5.RhoA/Rock/P-MLC分子通路可能參與TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重構(gòu)所致的通透性升高；Rock激酶抑制劑Y27632可以明顯減輕上述作用。
　　結(jié)論：
　　1.細(xì)胞骨架重構(gòu)可能是VEGF和TNF-α促進(jìn)HTNV感染致HUVECs的高通透性的重要機(jī)制之一。
　　2.RhoA/Rock/p-MLC分子通路可能是調(diào)節(jié)上述細(xì)胞骨架重構(gòu)的重要信號(hào)途徑，Rock激酶抑制劑Y276