龍葵與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)抗體對(duì)人大腸癌血管生成的影響.pdf

1、目的和背景：
　　實(shí)驗(yàn)研究大腸癌雞胚移植模型中,龍葵與 VEGF抗體表達(dá)以及兩者共同對(duì)大腸癌血管生成的影響。比較龍葵與VEGF抗體作用在雞胚絨毛尿囊膜上,人大腸腫瘤新生血管的面積及密度的差異;同時(shí)應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)。免疫組化法檢測(cè)CD34抗體(細(xì)胞表面的唾液粘蛋白)表達(dá)情況得出腫瘤微血管密度,應(yīng)用 LEICA圖像采集處理分析軟件反映雞胚血管新生情況有無(wú)差異,分析龍葵與VEGF抗體對(duì)雞胚移植模型

2、中人大腸癌促血管生長(zhǎng)這一機(jī)制的抑制作用。
　　龍葵:一年生草本植物,全草含龍葵堿、澳洲茄堿、澳洲茄邊堿等多種生物堿,民間較早就作為抗腫瘤藥應(yīng)生成的影響。腫瘤的血管生成這一觀點(diǎn)由 Folkman[1]于1971年首次提出,認(rèn)為腫瘤生長(zhǎng)與腫瘤血管生成密切相關(guān)。龍葵屬茄科,臨床發(fā)現(xiàn)對(duì)多種實(shí)體腫瘤及白血病等具有良好的防治療效,近年來(lái)國(guó)內(nèi)外開始涉足其抗腫瘤作用的有效成分和作用機(jī)制。龍葵堿可以通過改變膜蛋白的數(shù)量、功能、膜的通透性及 ATP酶

3、的活性等多個(gè)環(huán)節(jié)來(lái)改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能,從而達(dá)到抗腫瘤的作用。研究發(fā)現(xiàn)龍葵糖蛋白對(duì) HT-29(人大腸癌細(xì)胞)、MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞)、HCT-116(人直腸癌細(xì)胞)等多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒和促細(xì)胞凋亡作用。新近的研究表明龍葵提取物在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡時(shí)能增加細(xì)胞內(nèi) NO的合成,這可能是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一[2]。應(yīng)用激光共聚焦顯微術(shù)(LCM)觀察龍葵堿能明顯降低 S180和 H22荷瘤小鼠細(xì)胞RNA/DNA值,使腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA轉(zhuǎn)

4、錄形成RNA的代謝受到抑制,細(xì)胞內(nèi)基因產(chǎn)物——蛋白質(zhì)的合成受阻[3]。研究比較抑制正常發(fā)育血管,龍葵組龍葵量在15 mg時(shí)對(duì)血管新生的抑制作用不明顯,而當(dāng)龍葵量達(dá)25 mg時(shí),雞胚的發(fā)育受到明顯抑制或死亡,8只雞胚樣本中出現(xiàn)5只雞胚死亡。當(dāng)龍葵給藥量為20 mg時(shí),給藥48h后可見成形的胚胎活動(dòng),CAM上的給藥載體旁邊出現(xiàn)一個(gè)缺少血管的區(qū)域。龍葵總提取物對(duì) U266(多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞) G0-Gl期細(xì)胞數(shù)減少,S、G2-M期細(xì)胞數(shù)增加[

5、4]。龍葵醇提物可明顯延長(zhǎng)荷瘤肝癌小鼠生存時(shí)間,抑制肉瘤的生長(zhǎng)[5]。龍葵具有清熱解毒、活血消腫、利水通淋的功效,臨床上用龍葵水煎劑或注射劑治療宮頸癌、食道癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、絨毛膜上皮癌、卵巢癌、肉瘤等多種惡性腫瘤,均取得了一定的療效[6]。龍葵可明顯抑制雞胚絨毛尿囊膜血管新生[7]。實(shí)驗(yàn)表明低能量激光照射聯(lián)合龍葵多糖可以抑制腫瘤細(xì)胞中VEGF的生成,導(dǎo)致血管生成的環(huán)節(jié)受到抑制,腫瘤組織血管生成減少,阻斷腫瘤生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng),抑制腫瘤

6、細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移[8]。但是,龍葵是否具有抑制大腸癌新生血管的作用,至今還沒有相應(yīng)的研究,對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)作用還未見報(bào)道。
　　方法：
　　以9日齡的雞胚為模型,移植人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞于雞胚絨毛尿囊膜(CAM)上,孵箱培養(yǎng)1日后分別加入龍葵堿溶液(實(shí)驗(yàn)組1)、VEGF抗體(實(shí)驗(yàn)組2)及無(wú)菌PBS溶液(對(duì)照組),繼續(xù)培養(yǎng)5日,觀察移植瘤雞胚絨毛尿囊膜新生血管生成情況,測(cè)量其微血管密度、微血管面積。萊卡立體顯微鏡拍照存檔

7、,用 Image proplus6.0軟件分別分析實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組雞胚絨毛尿囊膜微血管面積;將石蠟包埋的雞胚絨毛尿囊膜移植瘤病理切片,采用 SP兩步法作免疫組化,檢查腫瘤組織的CD34抗原標(biāo)記的微血管密度;SPASS17.0軟件分析計(jì)算各組間微血管面積。
　　結(jié)果：
　　通過對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2與對(duì)照組間微血管面積及微血管密度間存在明顯差異,P<0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;實(shí)驗(yàn)組1與實(shí)驗(yàn)組2間存在明顯差異,P<0.0