TGFβ-Smad信號(hào)通路對(duì)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF-CTGF的影響.pdf

1、視網(wǎng)膜新生血管的形成機(jī)理與防治的研究已經(jīng)成為指導(dǎo)臨床新生血管性疾病治療的核心。目前對(duì)視網(wǎng)膜新生血管生成機(jī)理的研究深入到細(xì)胞因子(如VEGF、bFGF、TGFβ等)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的層面，但對(duì)這些細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究多是在單一因子水平進(jìn)行，對(duì)因子之間的級(jí)聯(lián)通路的研究尚未完全明了。已有許多研究表明TGEβ促進(jìn)VEGF的表達(dá)，也已獲知TGEβ有眾多的下游通路。是單一通路還是多條通路對(duì)VEGF起作用?其具體作用機(jī)理如何? 我們已經(jīng)知道Smad通路

2、是TGFβ的主要下游通路之一。以往關(guān)于Smad通路對(duì)VEGF的影響都是在TGFβ的介導(dǎo)下或是有其它細(xì)胞因子干預(yù)的研究，由于TGFβ可以激活眾多的細(xì)胞通路，通過(guò)其它的通路的干預(yù)VEGF蛋白的表達(dá)(如PKC、MAPK等通路)。因而了解單一Smad對(duì)VEGF的作用及Smad通路在視網(wǎng)膜新生血管中的作用具有理論與臨床意義。 第一部分TGFβ對(duì)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF、CTGF的影響。 目的：研究TGFβ對(duì)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞

3、中P-Smad2，3、VEGF、CTGF蛋白表達(dá)的影響。 方法：購(gòu)買人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞株體外培養(yǎng)，用含 10ng/mlTGFβ的ECM各2ml刺激人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞。分別在作用后1h、2h、6h、12h、24h，應(yīng)用 Westen-Blotting 蛋白印跡法檢測(cè)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中P-Smad2，3、VEGF、CTGF蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果：經(jīng)TGFβ刺激后人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中 P-Smad2，3、VEGF、C

4、TGF 蛋白的表達(dá)增加。P-Smad2蛋白的表達(dá)在不同時(shí)間組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，不同時(shí)間Smad3、VEGF及CTGF的表達(dá)有顯著性差異(P<0.05)。CTGF表達(dá)在作用后2小時(shí)達(dá)高峰，VEGF表達(dá)逐漸增加，24h達(dá)到最高峰。 結(jié)論： 1. TGFβ促進(jìn)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF、CTGF蛋白的表達(dá)，參與視網(wǎng)膜新生血管的形成。 2.在人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中也存在TGFB/Smad通路，TGFβ促

5、進(jìn)Smad2、3磷酸化(P-Smad2、3)，激活Smad通路。 3. P-Smad2蛋白的表達(dá)無(wú)時(shí)間依賴性，P-Smad3、VEGF及CTGF的表達(dá)呈時(shí)間相關(guān)性。 第二部分 Smad、VEGF、CTGF級(jí)聯(lián)的相互作用第一章 Smad 2，3、VEGF基因表達(dá)載體的構(gòu)建。 目的：構(gòu)建Smad2，3和VEGF基因表達(dá)載體。 方法：抽提胎肝組織總RNA，利用RT-PCR擴(kuò)增得到Smad2，3和VEGF基因的c

6、DNA序列，其中利用引物修飾Smad2，3的開放閱讀框，使之能和myc-his表位形成融合基因。純化、酶切目的基因PCR產(chǎn)物后與真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-his(-)B、pcDNA3.1(-)進(jìn)行連接。 結(jié)果：瓊脂糖凝膠電泳、PCR、Apa Ⅰ與Kpn Ⅰ雙酶切鑒定結(jié)果證實(shí)重組pcDNA3.1/myc-his(-)B-Smad2，3、pcDNA3.1/VEGF基因表達(dá)載體中所克隆的Smad2，3、VEGFcDNA的長(zhǎng)

7、度正確，測(cè)序結(jié)果證實(shí)本實(shí)驗(yàn)所克隆的Smad2，3、VEGFcDNA序列與GENE BANK所報(bào)道的序列一致。 結(jié)論： 1.成功克隆了Smad2，3、VEGF基因的cDNA序列。 2.成功構(gòu)建了 pcDNA3.1/myc-his(-)B-Smad2，3、pcDNA3.1/VEGF基因表達(dá)載體。 第二章 Smad、VEGF、CTGF級(jí)聯(lián)的相互作用。 目的：探討人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF、CTGF和

8、Smad2，3的相互作用。 方法：抽提和擴(kuò)增pcDNA3.1/myc-his(-)B-Smad2，3、pcDNA3.1/VEGF質(zhì)粒，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞。分成空白對(duì)照組(脂質(zhì)體組)、脂質(zhì)體+Smad2基因表達(dá)載體組、脂質(zhì)體+Smad3基因表達(dá)載體組、脂質(zhì)體+VEGF基因表達(dá)載體組。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后使用Real-time PCR和Westen-Blotting蛋白印跡法檢測(cè)Smad2，3對(duì)VEGF和CTGFmRNA和

9、蛋白表達(dá)的影響。Real-timePCR檢測(cè)VEGF對(duì)Smad2，3、CTGF mRNA表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1. 轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1/myc-his(-)B-Smad2質(zhì)粒后，細(xì)胞中Smad2mRNA的表達(dá)量比空白對(duì)照相比增加了41.4倍，CTGFmRNA增加了2.2倍，同時(shí)Smad3mRNA和VEGFmRNA分別下降了33.8倍和40.9倍；P-Smad2、CTGF蛋白較對(duì)照組增加，VEGF蛋白較對(duì)照組減少。

10、 2. 轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1/myc-his(-)B-Smad3 質(zhì)粒后，細(xì)胞中Smad2mRNA 的表達(dá)量與空白對(duì)照相比增加了2.2倍，Smad3mRNA表達(dá)增加了46.1倍，CTGF增加了2.6倍，同時(shí)VEGFmRNA下降了27.6倍；P-Smad3、CTGF蛋白較對(duì)照組增加，VEGF蛋白較對(duì)照組減少。 3. 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VEGF質(zhì)粒后，細(xì)胞中Smad2mRNA和Smad3mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比下降了7.

11、8倍和19.9倍，同時(shí)VEGFmRNA和CTGF分別mRNA增加了296.6倍和2.0倍。 結(jié)論： 1.基因表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，目的基因在細(xì)胞中高表達(dá)，Smad通路被激活。 2. Smad2，3均可以顯著下調(diào)VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)。 3. Smad2，3均可以上調(diào)CTGFmRNA和蛋白的表達(dá)。 4. Smad2及Smad3在人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中對(duì)VEGF、CTGF的作用基