苦參堿對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及VEGF表達(dá)的影響.pdf

1、目的：研究苦參堿（Matrine, Mat）對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（rat retinal microvascular endothelial cells，RRMECs）的增殖及VEGF表達(dá)的影響，明確其可否抑制視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及下調(diào)VEGF的表達(dá)，為視網(wǎng)膜新生血管的藥物防治提供新的思路和理論依據(jù)。 方法：原代培養(yǎng)RRMECs，取第三代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。MTT比色法檢測(cè)不同劑量Mat作用不同時(shí)間對(duì)RRMECs

2、增殖的抑制作用；臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定其對(duì)RRMECs生長(zhǎng)曲線的影響；AO/EB熒光雙染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的改變。將RRMECs按如下分組處理： （1）陰性對(duì)照組：用含20％血清DMEM培養(yǎng)； （2）陽(yáng)性對(duì)照組：含20％血清DMEM+血管抑素 130mg/L； （3）Mat組：含20％血清DMEM+Mat 40mg/L； （4）高糖組：含20％血清高糖DMEM（葡萄糖濃度 25mmol/L）；

3、 （5）Mat+高糖組。免疫細(xì)胞化學(xué)和Western-Blotting檢測(cè)不同分組處理48小時(shí)后細(xì)胞VEGF的表達(dá)。 結(jié)果： 1、MTT比色法測(cè)定結(jié)果顯示:用5、10、20、40、80、160mg/L的Mat處理RRMECs，作用24h細(xì)胞增殖抑制率分別為1.42±1.03％、11.50±1.98％、24.98±2.38％、40.27±2.49％、53.54±2.39％、63.88±3.12％;作用48h細(xì)胞增殖抑制率

4、分別為4.16±1.14％、14.40±1.78％、33.28±1.83％、53.61±1.32％、63.53±1.96％、73.79±1.12％;作用72h細(xì)胞增殖抑制率分別為9.83±2.13％、22.17±4.29％、42.65±1.05％、63.17±1.38％、74.35±2.60％、87.24±4.59％。在5mg/L以上各試驗(yàn)組與對(duì)照組相比均具有顯著性差異（P<0.05)，各試驗(yàn)組之間兩兩比較也具有顯著性差異（P<0.05

5、)。隨著濃度的增高，作用時(shí)間的增加， Mat抑制細(xì)胞增殖的作用越明顯，當(dāng)濃度達(dá)到40mg/L，作用48小時(shí)，細(xì)胞抑制率超過(guò)了50％。細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制生長(zhǎng)曲線結(jié)果與MTT結(jié)果相一致。 2、AO/EB熒光雙染色法觀察:在 Mat濃度達(dá)到40mg/L后處理RRMECs呈現(xiàn)不同程度的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征。 3、免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：VEGF表達(dá)定位于胞膜和胞漿,陽(yáng)性部分為棕黃色顆粒。血管抑素（130mg/L）和Mat(40mg/L)處

6、理后其陽(yáng)性表達(dá)明顯降低，灰度值越少（P<0.05）且兩者作用無(wú)明顯差別；高糖組的VEGF陽(yáng)性表達(dá)最高，灰度值也最大，Mat(40mg/L)同樣能下調(diào)其表達(dá)（P<0.05）。 4、Western-Blotting半定量檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)與免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果一致。 結(jié)論： 1、 Mat能有效地抑制體外培養(yǎng)的RRMECs的增殖，在一定的濃度和時(shí)間范圍內(nèi)其抑制作用呈明顯的劑量和時(shí)間依賴性； 2、Mat 能有效