超氧陰離子及過氧化氫對在體大鼠腸系膜微血管通透性的作用.pdf

1、氧化應(yīng)激過程中活性氧(ROS)的產(chǎn)生是包括心血管疾病在內(nèi)的很多疾病發(fā)病或?qū)е录膊〖又氐闹饕蛩?。作為心血管系統(tǒng)的第一道屏障，血管內(nèi)皮細胞易受活性氧影響出現(xiàn)功能失?；蛲ㄍ感栽黾?，但ROS對在體微血管通透性影響及其具體機制尚不清楚。 目的：本研究采用在體大鼠腸系膜微血管灌注的方法，觀察了中性粒細胞釋放ROS及外源性給予過氧化氫或超氧陰離子對微血管通透性、內(nèi)皮細胞鈣離子濃度、一氧化氮產(chǎn)生、細胞骨架蛋白、細胞粘附連接的影響，以初步研究超

2、氧陰離子及過氧化氫增加血管通透性的機制。 方法：fMLP刺激中性粒細胞懸液ROS的釋放通過測量化學(xué)發(fā)光進行定量。通過測定在體大鼠腸系膜微血管靜水傳導(dǎo)性觀察微血管通透性變化。采用鈣熒光指示劑(Fura2-AM)、NO熒光指示劑(DAF-2DA)標(biāo)記在體微血管內(nèi)皮細胞，并應(yīng)用熒光顯微鏡檢測細胞內(nèi)鈣或NO的熒光信號，觀察ROS對內(nèi)皮細胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)、NO的影響。通過激光共聚焦顯微鏡用免疫熒光染色的方法觀察超氧陰離子或

3、過氧化氫作用下，內(nèi)皮細胞F-肌動蛋白、VE-Cadherin的變化。 結(jié)果： 1.中性粒細胞釋放的ROS對在體大鼠微血管內(nèi)皮細胞通透性的影響fMLP(10μM)作用于中性粒細胞懸液(2×106個細胞/ml)可迅速增加化學(xué)發(fā)光值，由90.1±22.1RLU增至峰值617.4±32.7RLU(P<0.01)。同時，微血管灌注fMLP刺激的中性粒細胞懸液也可一過性增加微血管通透性至正常對照的3.6±0.6倍(P<0.01)，同

4、時增加內(nèi)皮細胞[Ca2+]i，由90.44±6.17nM增至峰值濃度296.87±10.61nM。而單獨灌注fMLP對微血管通透性及內(nèi)皮細胞[Ca2+]i無影響。使用SOD(1500U/ml)可抑制中性粒細胞ROS釋放所致微血管通透性變化及內(nèi)皮細胞[Ca2+]i的增加。 2.超氧陰離子和過氧化氫對在體大鼠微血管內(nèi)皮細胞通透性的影響： 通過微血管灌注次黃嘌呤(0.5mM)及黃嘌呤氧化酶(10mU/ml)以產(chǎn)生超氧陰離子可迅

5、速一過性增加微血管通透性，在給藥5min內(nèi)達到峰值，為正常對照的3.8±0.3倍(P<0.01)。與超氧陰離子不同，過氧化氫可緩慢地持續(xù)地增加微血管通透性。過氧化氫(100、500μM)灌注15min對微血管通透性無影響。500μM過氧化氫灌注30min可增加微血管通透性至正常對照的4.02±0.59倍(P<0.01)。100μM及500μM過氧化氫灌注60min可增加微血管通透性至正常對照的6.13±0.87倍及12.65±3.68倍

6、(P<0.01，P<0.05)。 3.超氧陰離子和過氧化氫對在體大鼠微血管內(nèi)皮細胞鈣的影響超氧陰離子可一過性增加內(nèi)皮細胞[Ca2+]i，由105.80±5.60nM升至峰值濃度397.20±80.01nM(P<0.01)。過氧化氫(100μM)可緩慢地持續(xù)性地增加微血管內(nèi)皮細胞[Ca2+]i。灌注過氧化氫15min、30min、60min，內(nèi)皮細胞[Ca2+]i分別為154.50±13.1l，231.33±31.64，714.5

7、8±144.70nM(P<0.01)。Ca2+通道阻滯劑氯化鑭(50μM)可抑制超氧陰離子及過氧化氫所引起的微血管通透性增加及內(nèi)皮細胞[Ca2+]i升高。 4.超氧陰離子和過氧化氫對在體大鼠微血管內(nèi)皮細胞內(nèi)NO產(chǎn)生的影響超氧陰離子及過氧化氫均可迅速增加內(nèi)皮細胞NO的產(chǎn)生，最高值分別為正常對照的254.9％±44.2％、1034.3％±44.3％(P<0.05，P<0.01)。NOS抑制劑L-NAME、AP-Cav-1可抑制超氧陰

8、離子及過氧化氫所引起的微血管通透性增加。AP-Cav-1對超氧陰離子及過氧化氫的Ca2+增加作用無抑制作用。 5.超氧陰離子和過氧化氫對在體大鼠微血管內(nèi)皮細胞細胞骨架和粘附連接的影響超氧陰離子或過氧化氫作用可引起血管內(nèi)皮細胞F-肌動蛋白形態(tài)及分布發(fā)生變化，細胞F-肌動蛋白分布紊亂不規(guī)則，細胞內(nèi)部有密集的應(yīng)力纖維形成。并改變內(nèi)皮細胞VE-Cadherin正常結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致粘附連接斷裂，細胞間裂隙形成。 結(jié)論： 1.fM

9、LP刺激中性粒細胞釋放超氧陰離子可增加大鼠微血管通透性及內(nèi)皮細胞[Ca2+]i。 2.黃嘌呤氧化酶和次黃嘌呤所產(chǎn)生的超氧陰離子可一過性增加微血管通透性，而過氧化氫可導(dǎo)致微血管通透性持續(xù)性增加。 3.超氧陰離子可一過性增加內(nèi)皮細胞[Ca2+]i，而過氧化氫可持續(xù)性增加微血管內(nèi)皮細胞[Ca2+]i。阻斷鈣內(nèi)流可抑制超氧陰離子及過氧化氫所引起的通透性變化。提示超氧陰離子及過氧化氫所致的通透性增加與細胞內(nèi)Ca2+增加有關(guān)。