炎癥條件下色素上皮衍生因子(PEDF)對(duì)血管通透性的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　嚴(yán)重?zé)齻髾C(jī)體迅速釋放大量的炎癥介質(zhì)，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞異?；罨推琳瞎δ苷系K，血管通透性增高，進(jìn)而引起低血容量性休克、筋膜間隙綜合征以及多器官功能障礙等一系列并發(fā)癥，嚴(yán)重危及患者的生命。目前對(duì)炎癥條件下引起血管通透性增高的因子及其作用機(jī)制尚未完全清楚。
　　膿毒癥作為大面積燒傷常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，其本質(zhì)為嚴(yán)重感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，可以模擬典型的炎癥條件。在前期研究中，我們通過液相芯片質(zhì)

2、譜分析發(fā)現(xiàn)色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)在嚴(yán)重?zé)齻摱景Y并發(fā)感染性暴發(fā)性紫癜患者的血清中表達(dá)顯著增高，但其在炎癥條件下對(duì)血管通透性的影響以及作用機(jī)制卻尚未研究。
　　之所以關(guān)注PEDF，是因?yàn)樗悄壳鞍l(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)新生血管抑制劑，它可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)引起的血管生成和血管通透性增高

3、。但是，近年來越來越多的文獻(xiàn)提示PEDF也可能是一種內(nèi)源性的血管活性物質(zhì)，它可能破壞血管內(nèi)皮屏障的完整性，這也是目前本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本研究旨在明確炎癥條件下血清PEDF的表達(dá)變化，并進(jìn)一步探討PEDF對(duì)血管通透性的影響及其相關(guān)機(jī)制。
　　材料和方法:
　　1.以膿毒癥模擬典型炎癥條件，采集嚴(yán)重?zé)齻摱景Y患者和三種不同膿毒癥小鼠(分別為嚴(yán)重?zé)齻摱景Y、盲腸結(jié)扎穿刺(cecal ligation and puncture，CL

4、P)膿毒癥和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的膿毒癥）的血清，同時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blotting，WB)的方法檢測血清中PEDF的表達(dá)變化。
　　2.制作CLP膿毒癥小鼠模型，尾靜脈注射外源性PEDF和PEDF單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)，觀察小鼠氣管血管

5、和提睪肌血管熒光微球漏出以及小鼠皮膚微血管伊文思藍(lán)(Evan's blue，EB)漏出情況，同時(shí)檢測小鼠血液中異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的右旋糖酐的熒光強(qiáng)度。
　　3.培養(yǎng)人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human dermal microvascular endothelial cells，HDMECs)，檢測細(xì)胞在不同濃度PEDF作用不同時(shí)間的條件下，跨細(xì)胞電阻(Transend

6、othelial electrical resistance, TER)的變化。
　　4.培養(yǎng)HDMECs，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、PEDF處理組、LPS處理組、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)處理組、PEDF+LPS聯(lián)合處理組和PEDF+TNF-α聯(lián)合處理組，檢測Transwell中FITC標(biāo)記的右旋糖酐漏出情況和RhoA激活情況，同時(shí)細(xì)胞免疫熒光染色觀察應(yīng)力纖維F-actin和緊密連接

7、閉鎖小帶(Zonula occludens-1，ZO-1)的形態(tài)變化。
　　5.外源性加入RhoA特異性抑制劑C3轉(zhuǎn)移酶，檢測細(xì)胞Transwell熒光漏出情況和RhoA激活情況，同時(shí)細(xì)胞免疫熒光染色觀察應(yīng)力纖維F-actin和緊密連接蛋白ZO-1的形態(tài)變化。
　　6.提取細(xì)胞膜蛋白和組織總蛋白，檢測PEDF的受體脂肪甘油三酯酯酶(Adiposetriglyceride lipase，ATGL)和層粘連蛋白受體（lamini

8、n receptor，LR）在炎癥條件下的表達(dá)變化，并采用免疫共沉淀(immunoprecipitation，IP)的方法檢測PEDF與其受體間的相互作用。
　　7.構(gòu)建PEDF受體的慢病毒干擾載體，分別干擾ATGL和LR，檢測Transwell熒光漏出情況和RhoA激活情況，同時(shí)細(xì)胞免疫熒光染色觀察緊密連接蛋白ZO-1的形態(tài)變化。
　　結(jié)果:
　　1.以膿毒癥模擬典型炎癥條件，我們發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)重?zé)齻摱景Y患者中，血清PE

9、DF的表達(dá)是顯著增高的。在三種膿毒癥小鼠中，血清PEDF的表達(dá)整體呈增高趨勢。具體而言，嚴(yán)重?zé)齻摱景Y小鼠血清PEDF水平從傷后6h開始增高，至12h達(dá)到峰值，隨后開始下降;CLP膿毒癥小鼠血清PEDF水平從傷后3h開始增高，至12h達(dá)到峰值，隨后開始下降;而LPS膿毒癥小鼠血清PEDF水平在傷后3h達(dá)到峰值，隨后出現(xiàn)波動(dòng)變化。
　　2.在正常小鼠中，大劑量PEDF單獨(dú)作用能夠引起血管通透性的增高，表現(xiàn)為熒光微球和EB漏出增多，血

10、液熒光強(qiáng)度降低。在膿毒癥小鼠中，血管通透性明顯高于正常小鼠，注入外源性PEDF能夠使得已經(jīng)增高的血管通透性進(jìn)一步增高，而注入PEDF-mAb則能抑制炎癥條件下血管通透性的增高。
　　3.PEDF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響呈現(xiàn)劑量和時(shí)間的依賴關(guān)系。
　　4.在LPS和TNF-α炎癥介質(zhì)處理?xiàng)l件下，內(nèi)皮細(xì)胞旁通透性增高，而外源性PEDF能夠使得已經(jīng)增高的細(xì)胞旁通透性進(jìn)一步增高，表現(xiàn)為Transwell中FITC標(biāo)記的右旋糖酐大量

11、漏出。PEDF增高內(nèi)皮細(xì)胞旁通透性主要是通過引起應(yīng)力纖維F-actin的重排和緊密連接蛋白ZO-1的分解。
　　5.大劑量PEDF單獨(dú)作用能夠引起RhoA的激活、應(yīng)力纖維F-actin的重排和緊密連接蛋白ZO-1的分解。在炎癥條件下，PEDF的這種效應(yīng)更加明顯，而RhoA的特異性抑制劑C3轉(zhuǎn)移酶能夠抑制PEDF增高血管通透性這一效應(yīng)。
　　6.在炎癥條件下，細(xì)胞膜表面和小鼠內(nèi)臟組織的ATGL受體表達(dá)增加，并且與PEDF的相互

12、作用增強(qiáng)，而LR受體無明顯變化。
　　7.在ATGL穩(wěn)定缺失的內(nèi)皮細(xì)胞中，外源性PEDF不能夠引起RhoA的激活、細(xì)胞旁通透性的增高和緊密連接蛋白ZO-1的分解。而在LR穩(wěn)定缺失的內(nèi)皮細(xì)胞中，外源性PEDF仍然能夠引起RhoA的激活、細(xì)胞旁通透性的增高和緊密連接蛋白ZO-1的分解。
　　結(jié)論:
　　炎癥條件下血清PEDF的表達(dá)顯著增高，與此同時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的PEDF受體ATGL的表達(dá)也顯著增多，PEDF與ATGL