Vasohibin-1調(diào)控肝細(xì)胞癌血管生成的初步研究.pdf

1、[研究背景和目的]
　　 原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界上最常見(jiàn)的實(shí)體惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響人類(lèi)的健康，在我國(guó)每年肝癌的發(fā)病率為20.37/10萬(wàn)，其死亡率高居癌癥死亡率的第二位。目前，手術(shù)切除和肝移植仍是目前最有效的治療手段，但療效不佳，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其最主要原因。HCC是個(gè)血供豐富的惡性腫瘤，血管生成被認(rèn)為與HCC的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此進(jìn)一步探討腫瘤血管生成在HCC侵襲轉(zhuǎn)移

2、中的分子機(jī)制有重要的理論意義和潛在的臨床實(shí)用價(jià)值。
　　 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vasculaurendothelialgrowthfactor，VEGF)是腫瘤血管生成中最主要的刺激因子，與HCC的侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成密切相關(guān)，被認(rèn)為是HCC血管生成中最主要的刺激因子。Vasohibin-1是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一個(gè)可以被VEGF或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF-2)誘導(dǎo)的血管生成負(fù)反饋抑制因子，因研究發(fā)現(xiàn)vasohibin-1參與腫瘤

3、、視網(wǎng)膜疾病等血管新生異常疾病的發(fā)生、發(fā)展備受關(guān)注。
　　 目前已有研究發(fā)現(xiàn)vasohibin-1在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌等有高表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。但在肝癌中尚未有相關(guān)研究?；谝陨涎芯勘尘?，本課題主要分析肝癌組織、肝癌細(xì)胞株中vasohibin-1基因/蛋白的表達(dá)水平;構(gòu)建靶向人vasohibin-1特異性RNA干擾慢病毒表達(dá)載體，體外轉(zhuǎn)染人高表達(dá)vasohibin-1肝癌細(xì)胞株，沉默肝癌細(xì)胞中vasohi

4、bin-1基因的表達(dá)，研究vasohibin-1基因被抑制后VEGF-A、MMP-9基因/蛋白水平的變化，以及對(duì)細(xì)胞周期、凋亡和增殖的影響，分析vasohibin-1作為新候選基因在調(diào)節(jié)肝癌血管生成中作用，初步探討vasohibin-1參與調(diào)節(jié)肝癌血管生成的可能分子機(jī)制以及慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默vasohibin-1基因在肝癌基因治療中的應(yīng)用前景，以開(kāi)辟治療肝癌的新途徑。
　　 [方法]
　　 1.Vasohibin-1

5、蛋白在肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義:選取山東省立醫(yī)院病理科存檔且臨床病理資料完整的117例肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)vasohibin-1、VEGF-A及腫瘤微血管密度(MVD，CD34標(biāo)記)的表達(dá)，分析vasohibin-1、VEGF-A和CD34的表達(dá)相關(guān)性以及和肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系;采用Kaplan-Meier法回顧性分析vasohibin-1蛋白表達(dá)與肝癌患者生存期的關(guān)系;應(yīng)用COX回歸模型分析單因素和

6、多因素危險(xiǎn)系數(shù)，尋找提高肝癌預(yù)后評(píng)價(jià)敏感性和特異性的相關(guān)指標(biāo)。
　　 2.Vasohibin-1基因/蛋白在不同肝癌細(xì)胞株和人正常肝細(xì)胞中的表達(dá):采用免疫細(xì)胞化學(xué)、熒光定量PCR(RealtimePCR)及Westemblot技術(shù)檢測(cè)不同侵襲、轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株中HepG2、SMMC-7721、BEL-7402和MHCC-97L及人正常肝細(xì)胞株L-02中vasohibin-1的表達(dá)情況，篩選出高表達(dá)vasohibin-1肝癌細(xì)胞

7、株。
　　 3.慢病毒介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞vasohibin-1基因沉默:構(gòu)建U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)、帶有綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)志的、表達(dá)針對(duì)vasohibin-1基因的慢病毒RNAi載體，轉(zhuǎn)染vasohibin-1高表達(dá)肝癌細(xì)胞，同時(shí)以轉(zhuǎn)染陰性載體的肝癌細(xì)胞作為對(duì)照。熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)以確定轉(zhuǎn)染效率，通過(guò)RealtimePCR、westem-blot分別檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后vasohibin-1基因和蛋白的表達(dá)情況，明確RNAi的抑制效率

8、，篩選出vasohibin-1沉默效率最高的干擾片段。
　　 4.Vasohibin-1沉默對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響:將篩選出的最佳慢病毒pGCSIL-vasohibin-1RNAi載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，沉默vasohibin-1的基因表達(dá)，通過(guò)四唑鹽比色法(MTT)檢測(cè)vasohibin-1干擾后對(duì)hepG2細(xì)胞增殖能力的變化;通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)vasohibin-1沉默后hepG2細(xì)胞遷移能力變化;應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)vas

9、ohibin-1沉默對(duì)hepG2細(xì)胞周期和凋亡的影響。RealtimePCR和westernblot方法檢測(cè)hepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGCSIL-vasohibin-1RNAi后VEGF-A和MMP-9的表達(dá)變化，探討vasohibin-1參與調(diào)節(jié)肝癌血管生成的可能分子機(jī)制。
　　 [結(jié)果]
　　 1.Vasohibin-1蛋白在肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義:免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示vasohibin-1蛋白在117例肝癌組織中的總

10、陽(yáng)性表達(dá)率為38.5％，明顯高于正常組織中陽(yáng)性表達(dá)16.2％。且與肝癌組織表達(dá)的VEGF-A、CD34以及肝癌血管侵襲特征密切相關(guān)(P=0.014，0.035，和0.002)。隨訪(fǎng)發(fā)現(xiàn)，vasohibin-1高表達(dá)患者5年復(fù)發(fā)率高，生存率明顯低于vasohibin-1低表達(dá)患者。將vasohibin-1表達(dá)，臨床病理特點(diǎn)等參數(shù)與肝癌患者復(fù)發(fā)和生存時(shí)間進(jìn)行單因素和多因素分析，結(jié)果顯示vasohibin-1，VEGF-A和腫瘤TNM是影響肝

11、癌復(fù)發(fā)和生存預(yù)后的獨(dú)立因素(P=0.002、0.006、0.022)。
　　 2.Vsohibin-1基因/1蛋白在肝癌細(xì)胞株和正常肝細(xì)胞株中的表達(dá)情況:RealtimePCR和western-blot檢測(cè)證實(shí)肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721、BEL-7402和MHCC-97L中vasohibin-1基因和蛋白水平明顯高于人正常肝細(xì)胞株L-02，而且以hepG2中vasohibin-1表達(dá)含量最高，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異具有統(tǒng)計(jì)

12、學(xué)意義。細(xì)胞免疫組織化學(xué)證明vasohibin-1表達(dá)在hepG2細(xì)胞胞漿。
　　 3、慢病毒介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞vasohibin-1基因沉默:以vasohibin-1mRNA基因序列為靶目標(biāo)進(jìn)行干擾片段設(shè)計(jì)，成功構(gòu)建了四對(duì)針對(duì)vasohibin-1基因不同位點(diǎn)的特異性RNA干擾序列，經(jīng)化學(xué)修飾后與pGCSIL-GFP慢病毒載體連接，通過(guò)轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，鑒定干擾片斷的堿基序列及插入位點(diǎn)完全正確;在293T細(xì)胞中包裝慢病毒

13、，獲得高滴度慢病毒上清;利用重組慢病毒載體將vasohibin-1RNAi轉(zhuǎn)導(dǎo)入肝癌細(xì)胞hepG2中，熒光顯微鏡測(cè)定轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到80％以上，RealtimePCR結(jié)果顯示:pGCSIL-vasohibin-1RNAi-1，2，3，4組中vasohibin-1mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為空白對(duì)照組的33.1％，56.5％，48.3％和81.6％;Westernblot結(jié)果顯示，pGCSIL-vasohibin-1RNAi-1，2，3，4組v

14、asohibin-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平與空白對(duì)照組相比下降，其中，又以vasohibin-1RNAi靶點(diǎn)1效果最好(P＜0.05)。綜合RealtimePCR和Westernblot結(jié)果，4組干擾片段中，vasohibin-1RNAi靶點(diǎn)1的干擾效果最高。因此，選用vasohibin-1RNAi靶點(diǎn)1干擾片段進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 4、Vasohibin-1沉默對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響:MTT法觀察vasohibin-1基因表達(dá)沉

15、默后體外細(xì)胞的增殖情況，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，細(xì)胞的增殖速度明顯減慢，與呈時(shí)間依賴(lài)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示下調(diào)vasohibin-1基因表達(dá)抑制hepG2細(xì)胞增殖，使其生長(zhǎng)速度減緩;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)vasohibin-1RNAi轉(zhuǎn)染后對(duì)hepG2細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)干擾影響不明顯(P＞0.05);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)vasohibin-1基因表達(dá)沉默后體外細(xì)胞的周期和凋亡情況，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，細(xì)胞周期中S期的比例明顯減少，G2/M期明

16、顯增多，細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示抑制vasohibin-1基因表達(dá)影響hepG2細(xì)胞周期的進(jìn)程，使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，而且細(xì)胞凋亡細(xì)胞增多;RealtimePCR和western-blot顯示利用RNAi技術(shù)沉默vasohibin-1基因表達(dá)，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，vasohibin-1基因下調(diào)后對(duì)MMP-9的基因/蛋白表達(dá)水平?jīng)]有影響，卻可以在基因/蛋白質(zhì)水平下調(diào)VEGF-A的表達(dá)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

17、＜0.05)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.Vasohibin-1蛋白在肝癌組織中高表達(dá)，在癌旁組織中弱表達(dá)，且與肝癌的血管侵襲、VEGF-A，CD34表達(dá)有相關(guān)性，而且與患者預(yù)后有關(guān)，表明vasohibin-1可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子，vasohibin-1可作為臨床檢測(cè)的有重要參考價(jià)值的標(biāo)志物，對(duì)判斷肝癌預(yù)后有重要意義;
　　 2.RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞hepG2后，vasohibin-1在mRNA及蛋

18、白水平被顯著、持久沉默;Vasohibin-1基因的沉默影響hepG2的細(xì)胞周期，發(fā)生G2/M期阻滯，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞的生長(zhǎng)速度減慢，凋亡增加，并能夠下調(diào)VEGF-A的表達(dá)下調(diào)，提示vasohibin-1可能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF-A的表達(dá)而參與肝癌細(xì)胞血管生成的調(diào)節(jié)，vasohibin-1有望成為肝癌基因治療的潛在靶點(diǎn)。
　　 3.成功篩選出能高效沉默vasohibin-1的慢病毒表達(dá)載體，該載體能有效感染hepG2細(xì)胞