Vasohibin1對結腸癌血管生成調(diào)控和腫瘤細胞抑制功能的臨床和分子機制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　結腸癌是常見的惡性腫瘤，在美國每年大約有100，000新增病例、50，000死亡病例，在我國結直腸癌發(fā)病率約占所有惡性腫瘤的10％-15％。結腸癌的治療手段包括手術、放療、化療、分子靶向治療等，結腸癌經(jīng)過根治性切除術和輔助化療，在5年內(nèi)仍有較高的復發(fā)率。研究表明，腫瘤的血管生成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、復發(fā)轉移中起著關鍵作用。腫瘤血管生成是一種動態(tài)過程，是血管生成促進因子和血管生成抑制因子相互作用的結果。
　　

2、Vasohibin1是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的血管抑制因子。Vasohibin(VASH)家族包括VASH1和VASH2。VASH1由VEGF-A和FGF-2刺激產(chǎn)生，并選擇性的表達于血管內(nèi)皮細胞。VASH1有兩個亞型VASH1-A和VASH1-B。VASH1的同源異構體VASH2主要表達于單核細胞。VASH1多表達在血管內(nèi)皮生成的終末區(qū)，抑制新生血管形成。VASH2多表達在血管內(nèi)皮生成的起始端，促進血管形成。VASH1作為血管生成抑制劑在腫

3、瘤血管生成過程中發(fā)揮重要的作用。
　　研究發(fā)現(xiàn)VASH1在乳腺癌、尿路上皮癌、肝癌、肺癌等癌組織的血管內(nèi)皮中高表達，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及復發(fā)、轉移密切相關，但在結腸癌中尚未有相關研究。此外VASH1不僅表達于血管內(nèi)皮，近年研究發(fā)現(xiàn)VASH1還表達于腫瘤細胞。但其具體的生物學功能，尤其在調(diào)節(jié)腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展方面的功能，尚不清楚。
　　基于以上研究背景，本課題主要通過分析VASH1在結腸癌組織中的表達情況，回顧性分析腫瘤血管

4、內(nèi)皮細胞中VASH1的表達和腫瘤細胞中VASH1的表達與臨床病理資料的相關性;使用VASH1-A和VASH1-B的過表達質粒，轉染結腸癌細胞系HT29，使用shRNA干擾、沉默結腸癌細胞系HCT116中VASH1基因的轉錄表達。通過以上途徑，研究VASH1對結腸癌細胞生長、粘附、遷移等生物學行為的影響及其機制，探討VASH1通過激活、參與細胞的凋亡、衰老，發(fā)揮其對腫瘤細胞的抑制作用;使用皮下移植瘤模型和腫瘤轉移模型，進一步驗證VASH1

5、對結腸癌腫瘤細胞生長和轉移的影響及其機制，為結腸癌靶向治療，開辟新的方向和途徑。
　　方法:
　　1.VASH1在結腸癌組織中的表達及臨床意義:選取山東省濟南市中心醫(yī)院病理科存檔且臨床病理資料完整的75例結腸癌癌組織及相應癌旁組織，應用免疫組織化學方法檢測在結腸癌組織中，VASH1在血管內(nèi)皮的表達、VEGF-A、VEGF-C的表達，以及腫瘤微血管密度（MVD，CD34標記）、腫瘤微淋巴管密度（LVD，D2-40標記），分析血

6、管內(nèi)皮表達VASH1與VEGF-A、CD34、VEGF-C、D2-40表達的相關性，及其與結腸癌相關臨床病理特征的相關性。
　　2.應用免疫組織化學方法，檢測VASH1在結腸癌組織中腫瘤細胞的表達，分析結腸癌組織中，腫瘤細胞表達VASH1與結腸癌相關臨床病理特征的相關性。
　　3.使用Real Time PCR和Weastern Blot方法，檢測VASH1在不同結腸癌細胞系中的表達，篩選VASH1的高表達細胞系和低表達細胞

7、系。
　　4.選用VASH1低表達細胞系HT29，轉染、過表達VASH1-A和VASH1-B，通過繪制生長曲線、3H-TdR摻入實驗、平板克隆實驗，檢測VASH1對結腸癌細胞生長、增值的影響;通過SA-β-gal染色和流式細胞術，檢測VASH1對結腸癌細胞衰老和凋亡的影響。
　　5.VASH1過表達人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞，通過小管形成實驗，檢測其對血管形成的影響。
　　6.VASH1敲除對結腸癌細胞生物學行為的影響:sh

8、RNA轉染VASH1高表達細胞系HCT116，敲除、沉默VASH1的表達。通過生長曲線、3H-TdR摻入實驗、平板克隆實驗，研究VASH1對結腸癌細胞生長、增值的影響。應用粘附實驗檢測VASH1對腫瘤細胞粘附能力的影響。通過Transwell遷移實驗和劃痕實驗檢測VASH1對腫瘤細胞遷移能力的影響。
　　7.VASH1過表達移植瘤模型建立:裸鼠皮下注射過表達VASH1-A、VASH1-B及空載體的結腸癌HT29細胞(5×106)。

9、注射后每隔3天用游標卡尺測量腫瘤大小，繪制移植瘤生長曲線。腫瘤超過2cm處死小鼠，取出腫瘤組織并稱重。移植瘤組織免疫組化檢測KI-67、Cleaved Caspase-3及CD34，研究VASH1在體內(nèi)對結腸癌細胞生長、增值、凋亡及血管生成的影響;移植瘤組織SA-β-gal染色，檢測VASH1在體內(nèi)對組織衰老機制的影響。
　　8.VASH1沉默移植瘤模型建立:Rag1-/-小鼠皮下注射轉染shRNA及ControlshRNA的HC

10、T116(4×106)。其余方法同步驟6。
　　9.轉移瘤模型建立:尾靜脈注射法將轉染shRNA及Control shRNA的HCT116(2×106)注射到Rag1-/-小鼠體內(nèi)。注射6周后處死小鼠，取肺、肝組織，解剖顯微鏡下計數(shù)轉移灶。使用OCT包埋組織速凍后，切片HE染色驗證轉移灶。
　　結果:
　　1.VASH1蛋白在結腸癌組織間質的血管內(nèi)皮細胞中表達，而不表達于間質的淋巴管內(nèi)皮細胞。過表達VASH1-A或VA

11、SH1-B的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，可形成不完整的管狀結構，且其分支點數(shù)低于空白載體組，差異有顯著性(p≤0.01)。VASH1在結腸癌組織間質的表達明顯高于癌旁組織(p＜0.01)，兩者呈正相關(p=0.004)。VEGF-A、CD34、VEGF-C、D2-40在結腸癌腫瘤組織中的表達，均高于癌旁組織(p＜0.01)。結腸癌腫瘤間質VASH1的表達與MVD表達呈正相關，與VEGF-A、VEGF-C、LVD無相關性。結腸癌腫瘤間質VASH1的

12、表達與腫瘤體積(p=0.021124)、腫瘤臨床分期(p=0.0069078)、遠處轉移(p=0.0031225)呈負相關。
　　2.VASH1在結腸癌細胞中的表達及臨床意義:免疫組化檢測結果顯示在結腸癌組織切片中，VASH1也腫瘤細胞中表達，并與遠處轉移呈正相關(p=0.01613)。
　　3.VASH1在腫瘤細胞系的表達:Real Time PCR檢測VASH1-A、VASH1-B在腫瘤細胞系中的表達。VASH1-A在所

13、檢測的腫瘤細胞系中均有表達，其中乳腺癌MCF7表達最高。結腸癌細胞系中HT29表達最低，HCT116表達最高。VASH1-B在所檢測的腫瘤細胞系中均有表達，其中乳腺癌MCF7表達最高。結腸癌細胞系中HT29表達最低，HCT116表達最高。
　　4.過表達VASH1對結腸癌細胞生物學行為的影響:通過生長曲線、3H-TdR摻入實驗、平板克隆實驗，檢測過表達VASH1-A、B基因后對HT29細胞生長、增殖的影響。與對照組相比，VASH1

14、過表達組細胞的生長、增殖及克隆形成能力明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，提示過表達VASH1-A、B基因抑制HT29細胞增殖，使其生長速度減緩，克隆形成能力降低;流式細胞儀檢測結果提示過表達VASH1-B促進腫瘤細胞凋亡(p＜0.01)。SA-β-gal染色結果提示過表達VASH1-A促進腫瘤細胞衰老(p＜0.01)。
　　5.敲除VASH1對結腸癌細胞生物學行為的影響:通過生長曲線、3H-TdR摻入實驗、平板克隆實驗，

15、檢測沉默VASH1基因后HCT116細胞的增殖情況。與對照組相比，shRNA干擾組細胞的增殖速度顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。粘附實驗結果，shRNA干擾、沉默VASH1顯著提高HCT116細胞的粘附能力。Transwell遷移實驗和劃痕實驗結果顯示，shRNA干擾、沉默VASH1顯著增強HCT116細胞的遷移能力(p＜0.05)。
　　6.通過HT29細胞裸鼠皮下移植模型，觀察VASH1在體內(nèi)對結腸癌細胞增值的影響

16、:腫瘤體積曲線顯示，VASH1-A、VASH1-B過表達組腫瘤生長速度顯著低于空載體對照組(p=0.025)。檢測腫瘤重量提示，空載體對照組腫瘤重量明顯高于VASH1-A、VASH1-B過表達組(p＜0.01)。免疫組合檢測顯示，VASH1-A、VASH1-B過表達組，腫瘤組織KI-67的表達小于空載體對照組(p＜0.05);VASH1-B過表達組，腫瘤組織Cleaved Caspase-3的表達顯著高于空載體對照組(p＜0.01);腫

17、瘤組織表達的CD34在三組間無明顯差異。SA-β-gal染色結果顯示，VASH1-A過表達組，陽性細胞高于空載體對照組(p＜0.05)。
　　7.通過HCT116細胞Rag1-/-小鼠皮下移植模型，觀察VASH1在體內(nèi)對結腸癌細胞增值的影響:腫瘤體積曲線顯示，shRNA沉默組腫瘤生長速度顯著快于control shRNA組(p＜0.01)。腫瘤重量結果顯示，shRNA沉默組腫瘤重量大于control shRNA組(p＜0.05)。

18、免疫組化結果提示，shRNA沉默組KI-67表達高于control shRNA組。
　　8.通過HCT116細胞Rag1-/-小鼠轉移瘤模型，觀察VASH1對結腸癌轉移的影響:成模后6周取肺、肝組織，計數(shù)表面腫瘤表面轉移灶。切片HE染色進行病理形態(tài)學觀察。結果提示，shRNA沉默組肺組織的腫瘤轉移灶(p＜0.05)及肝組織的腫瘤轉移灶(p＜0.01)明顯高于control shRNA組，差別有統(tǒng)計學意義。
　　結論:

19、　　1.VASH1表達于結腸癌間質的血管內(nèi)皮細胞，抑制血管生成并與腫瘤體積、臨床分期、遠處轉移呈負相關。
　　2.VASH1表達于結腸癌組織的腫瘤細胞，與腫瘤的遠處轉移成正相關。提示腫瘤細胞表達的VASH1，與血管內(nèi)皮細胞中表達的VASH1功能不同。
　　3.誘導VASH1在結腸癌細胞中過表達、沉默，證實VASH1可以抑制結腸癌細胞的生長、增值、粘附及遷移。
　　4.VASH1-A參與誘導結腸癌細胞衰老;VASH1-B