抗雞大腸桿菌的1型菌毛的單克隆抗體的研究和pilA基因的融合表達(dá)及其重組菌毛蛋白免疫原性研究.pdf

1、　　1，提取JM10大腸桿菌菌毛，經(jīng)12﹪的聚丙烯酰胺凝膠電泳。切取菌毛蛋白條帶制成油乳劑抗原，免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)間接ELISA篩選獲得2株能穩(wěn)定分泌針對(duì)1型菌毛的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。單抗阻斷甘露糖敏感血凝試驗(yàn)和Westernblot試驗(yàn)證明，這兩株單抗都是1型菌毛特異的。這2株單抗的直接凝集價(jià)分別為25～26、28～29，ELISA效價(jià)分別為103、104～105。應(yīng)用這2株單抗對(duì)46株帶1型

2、菌毛的禽病原性大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型分離株進(jìn)行了檢測(cè)，單抗可以快速，簡(jiǎn)便的鑒定致病性的分離株，同時(shí)還可為后來(lái)的抗原性檢測(cè)試驗(yàn)提供標(biāo)準(zhǔn)菌毛抗體。　　2.根據(jù)人大腸桿菌的pilA序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，從基因組中擴(kuò)增大小為551bp目的基因pilA，定向克隆到T載體質(zhì)粒，測(cè)序，然后克隆到表達(dá)載體pET-32a(+)中。陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測(cè)，接著，對(duì)此重組菌株的表達(dá)條件從表達(dá)的情況、表達(dá)時(shí)間、I

3、PTG的濃度等各方面進(jìn)行優(yōu)化.從而確立高效表達(dá)的條件。利用鎳柱，提純JM10菌株1型菌毛結(jié)構(gòu)基因的重組蛋白。通過間接ELISA和Western-blot方法，與相應(yīng)的單抗4D3和相關(guān)血清型O78的單抗和血清型O18的多價(jià)抗血清反應(yīng)，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該重組pilA基因重組蛋白具有菌毛蛋白的抗原性，存在交叉反應(yīng)，進(jìn)一步的說(shuō)，1型菌毛之間存在相同的抗原位點(diǎn)，有一定的相關(guān)性。　　3.將提純的重組蛋白和天然菌毛疫苗免疫小雞，第三周，用同源致病性菌株

4、氣囊攻毒。同時(shí)設(shè)立非免疫雞只攻毒對(duì)照，和非免疫非攻毒對(duì)照。觀察雞只的情況。攻毒4日后，非免疫攻毒組87.5﹪死亡。重組菌毛免疫組死亡率為25﹪，天然菌毛免疫組死亡率僅為12.5﹪，而天然菌毛疫苗的保護(hù)率高達(dá)87.5﹪。所有試驗(yàn)組雞群剖解，從肝、心和氣囊等部位觀察機(jī)體的病理變化，免疫攻毒的兩組雞群且在肝臟、心包、氣囊的病變比未免疫雞顯著輕微，重組菌毛免疫組比天然菌毛免疫組癥狀顯著。從而說(shuō)明，重組蛋白具有免疫保護(hù)作用。重組菌毛疫苗的保護(hù)力比