水體中大腸桿菌快速檢測方法和儀器的研究.pdf

1、大腸桿菌是人和動物腸道中的常居菌,常隨人及動物糞便一塊排出,廣泛傳播于自然環(huán)境中,對水源造成污染。在衛(wèi)生質(zhì)量的評價和控制中,通常采用大腸桿菌作為指示菌來了解水體的受污染狀況,從而評價其質(zhì)量以保證衛(wèi)生安全。因此,建立水體中大腸桿菌的快速檢測方法,成為環(huán)境保護、飲水衛(wèi)生、食品衛(wèi)生和流行病學領(lǐng)域中最重要的研究對象之一。
　　大腸桿菌的傳統(tǒng)檢測方法,如濾膜法,多管發(fā)酵法等,雖然結(jié)果比較準確,但是都存在著檢測周期長、程序復雜、所需試劑繁多等

2、缺點。目前,國內(nèi)外研究人員已經(jīng)發(fā)展一些新方法對大腸桿菌進行快速檢測,主要包括酶底物法、聚合酶鏈法、免疫分析法、電化學方法、熒光法等。這些方法雖然縮短了檢測時間,簡化了檢測流程,但是普遍降低了檢測的靈敏度和選擇性。因此亟需一種既快速,又能保持高靈敏度,高選擇性的大腸桿菌檢測方法。
　　近年來,隨著納米科技的發(fā)展,納米材料所特有的許多優(yōu)異特性使其在分析化學中得到了越來越多的應用。本論文運用碳納米管和磁性納米顆粒等納米材料制備了Tyr/

3、MWNTs-Chit/GCE生物傳感器和Tyr/Fe3O4 MNPs-CNTs/GCE生物傳感器以快速檢測大腸菌群,檢測時間可控制在5 h之內(nèi),檢測限低至10 cfu/mL。根據(jù)磁性納米顆粒良好的生物兼容性的特點,又將生物功能化的磁性納米顆粒（BMNPs）和三磷酸腺苷（ATP）生物發(fā)光法相結(jié)合發(fā)展了了一種靈敏、特異性的大腸桿菌快速檢測方法,并應用于檢測無菌牛奶中培養(yǎng)的大腸桿菌,可獲得較低的檢測限（20 cfu/mL）和較短的檢測時間（約

4、1 h）。
　　論文主要包括以下幾個部分:
　　第一章緒論簡要介紹了大腸桿菌的生物特性、致病性以及衛(wèi)生標準?？偨Y(jié)了檢測大腸桿菌的傳統(tǒng)方法以及酶底物法、聚合酶鏈反應技術(shù)、免疫檢測技術(shù)和化學發(fā)光法等新方法。然后回顧了納米材料的特性、制備和表征方法,并就納米材料在快速檢測大腸桿菌中的應用展開了討論。
　　第二章Tyr/MWNTs-Chit/GCE生物傳感器的制備及其在快速檢測大腸菌群中的應用基于多壁碳納米管（MWNTs）-殼

5、聚糖（Chit）復合物,制備了一種靈敏、穩(wěn)定的酪氨酸酶（Tyr）生物傳感器。由于MWNTs-Chit復合物良好的生物兼容性和電催化能力,Tyr/MWNTs-Chit/GCE生物傳感器在苯酚的檢測中具有高靈敏度（412 mA/M）,低檢測限（5.0 nM）,較寬的線性范圍(1.0×10-8-2.8×10-5M)以及良好的穩(wěn)定性（10天后仍保持93％的活性）。把Tyr/MWNTs-Chit/GCE生物傳感器進一步應用于大腸菌群的檢測,大腸菌

6、群在104-107cfu/mL范圍內(nèi)與電流響應成正比;經(jīng)過5 h的培養(yǎng),進一步降低大腸菌群的檢測限至10 cfu/mL。
　　第三章Tyr/Fe3O4 MNPs-CNTs/GCE生物傳感器在流動注射法快速檢測大腸菌群中的應用該文基于Fe3O4磁性納米顆粒（MNPs）-碳納米管（CNTs）復合物修飾電極制備了一種靈敏,穩(wěn)定的酪氨酸酶（Tyr）生物傳感器,并進一步應用于流動注射法（FIA）檢測大腸菌群。CNTs表面包裹了帶正電荷的聚二

7、甲基二丙烯氯化銨（PDDA）,從而可以吸附帶負電荷的Fe3O4 MNPs。制得的Fe3O4 MNPs-CNTs納米復合物被修飾在光玻碳電極上,而Tyr則通過戊二醛交聯(lián)在此修飾電極上。這種基底為保持Tyr的生物活性提供了良好的微環(huán)境,其中的CNTs還可以改善對苯酚的電化學檢測。這種Tyr生物傳感器在苯酚的檢測中顯示了較寬的線性范圍(1.0×10-8-3.9×10-5M),較低的檢測限(5.0×10-9M)和較高的靈敏度（516 mA/M）

8、。而且,這種生物傳感器與FIA系統(tǒng)聯(lián)用可以用來檢測以大腸桿菌（E.coli）為代表的大腸菌群。其原理是檢測大腸菌群溶液中酶反應產(chǎn)物苯酚的濃度。在最優(yōu)的實驗條件下,FIA系統(tǒng)檢測到的電流響應與細菌濃度呈在20到1×105cfu/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,其檢測限低至10 cfu/mL,并且總檢測時間可控制在4h之內(nèi)。這種生物傳感器-FIA檢測系統(tǒng)可以應用于快速的自動臨床診斷和水質(zhì)分析。
　　第四章結(jié)合生物功能化的磁性納米顆粒和ATP生物

9、發(fā)光法快速檢測大腸桿菌該文將生物功能化的磁性納米顆粒（BMNPs）和三磷酸腺苷（ATP）生物發(fā)光法相結(jié)合發(fā)展了了一種快速、靈敏、特異性的大腸桿菌快速檢測方法。BMNPs是通過固定一種特異性大腸桿菌抗體在胺基功能化的磁性納米顆粒表面（直徑約20 nm）來制備的,用來捕獲樣品中的大腸桿菌。從透射電子顯微鏡（TEM）圖像上可以看出BMNPs會吸附在整個大腸桿菌的表面,從而使大腸桿菌具有磁性,可以通過施加外部磁場很容易地從樣品中分離出來。利用B

10、MNPs分離出來的大腸桿菌的濃度可以通過ATP生物發(fā)光法測定。通過優(yōu)化ATP生物發(fā)光法的檢測條件提高了整個方法的靈敏度。此檢測方法應用于檢測無菌牛奶中培養(yǎng)的大腸桿菌可獲得較低的檢測限（20 cfu/mL）和較短的檢測時間（約1 h）。
　　第五章細菌快速分析儀的研制本章基于細菌的生物學特性以及電化學工作原理開發(fā)研制了細菌快速分析儀,儀器對細菌的檢測具有快速、靈敏、準確等特點,不但可檢測水體中細菌總量,而且還可檢測水體中的大腸桿菌的