基于PCR-FRET的大腸桿菌快速檢測(cè)新方法的建立.pdf

1、在自然環(huán)境中，飲用水水源很容易受到病原微生物的侵染，被污染的水體中，通常能檢測(cè)出大量的致病菌和腸道病毒。大腸桿菌作為水源中病原菌的標(biāo)準(zhǔn)指示菌，對(duì)水質(zhì)安全監(jiān)測(cè)具有重要意義，我國(guó)國(guó)標(biāo)GB5749-2006生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中嚴(yán)格規(guī)定:飲用水的大腸桿菌限值為每100mL不得檢出。然而，目前大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法仍以傳統(tǒng)檢測(cè)方法為主，這些檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣，不適合對(duì)水樣進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。如何快速準(zhǔn)確檢測(cè)出水體中大腸桿菌稱(chēng)為人們研究的熱點(diǎn)。

2、r>　　本論文圍繞大腸桿菌快速檢測(cè)來(lái)展開(kāi)研究工作，選取高特異性、高靈敏度的PCR和具有準(zhǔn)確定量的FRET原理來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)。
　　首先建立普通PCR法。選取大腸桿菌的特異性保守性基因uidA作為目標(biāo)檢測(cè)物，對(duì)uidA進(jìn)行引物設(shè)計(jì)后進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，在保證引物的特異性和準(zhǔn)確性后克隆成質(zhì)粒，并根據(jù)質(zhì)粒對(duì)PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行篩選和調(diào)控，最后得到最佳的PCR擴(kuò)增條件。
　　然后建立QDs-Cy5基的FRET檢測(cè)體

3、系。選取反應(yīng)條件溫和的水相回流法來(lái)合成CdTe量子點(diǎn)，通過(guò)調(diào)節(jié)回流時(shí)間得到一系列發(fā)光效率較好的量子點(diǎn)。選取量子產(chǎn)率為53％、發(fā)射在602 nm的CdTe量子點(diǎn)為FRET的供體，根據(jù)F(o)rster原理對(duì)比量子點(diǎn)與染料的吸收和發(fā)射光譜，選取在600 nm左右有較強(qiáng)吸收的花菁染料Cy5作為FRET的受體。根據(jù)目的DNA設(shè)計(jì)的一組適配子，與供受體對(duì)連接后形成捕獲探針和報(bào)告探針，兩組探針可與目的DNA特異性結(jié)合形成夾心結(jié)構(gòu)并通過(guò)FRET來(lái)實(shí)現(xiàn)

4、對(duì)目的DNA的檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)中可能影響的因素進(jìn)行適當(dāng)調(diào)控后，成功對(duì)uidA基因進(jìn)行了檢測(cè)，其檢測(cè)限為2 nmol/L，且在2nmol/L-100 nmol/L范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性系數(shù)為0.999。
　　最后聯(lián)立PCR-FRET，其可在3h內(nèi)完成對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)。對(duì)uidA基因的檢測(cè)結(jié)果顯示其可檢測(cè)到30copies的uidA，比普通PCR法的檢測(cè)限約低一個(gè)數(shù)量級(jí);該方法可檢測(cè)大腸桿菌濃度在103-107 CFU/mL范圍內(nèi)的