多重熒光PCR檢測產vero毒素大腸桿菌（VTEC）方法的研究及初步應用.pdf

1、產Vero毒素大腸埃希氏菌(Vcrocytotoxin-producing Escherichia coli，VTEC)，又稱產類志賀氏菌毒素大腸桿菌(Shiga-like toxin-producingEscherichia coli，SLTEC)，是指能夠產生對Vero細胞和Hela細胞有毒性的VT1、VT2及VT1、VT2變異毒素的一群大腸埃希氏菌。 該類菌主要通過食物傳播，動物產品有可能是感染人類的主要來源。能引起任何動

2、物的溶血性尿毒綜合癥(HUS)、出血性結腸炎(HC)和血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等嚴重疾病。目前世界上許多發(fā)達國家和一部分發(fā)展中國家都發(fā)生過VTEC的暴發(fā)流行，成為全球性的公共衛(wèi)生問題。新加坡官方已明確要求，所有對新進口的肉食品必須檢測VTEC，因此建立快速準確的診斷方法已成為動物產品檢疫的迫切要求。 實時熒光PCR技術是一種新型的核酸檢測技術，在臨床診斷中已經用于細菌、病毒及遺傳性疾病的檢測，具有極大的應用價值。本研究中

3、依據SYBR Green I能和雙鏈DNA結合的特性，根據VT1和VT2毒素基因的保守性分別設計一對引物，進行多重熒光PCR反應，從而為出口肉食品檢測和臨床診斷提供有力的依據。本課題分兩部分進行研究。 試驗一產vero毒素大腸桿菌(VTEC)多重熒光PCR檢測方法的建立該研究的目的是通過比較Genbank中已發(fā)表的VT基因序列的同源性，設計特異性引物，利用該引物進行PCR擴增，結果只有以VTEC的DNA為模板可以擴增出95bp和

4、108bp的特異條帶。利用SYBR Green I能和雙鏈DNA結合的特性，通過對試驗條件的優(yōu)化，實現了對VTEC的實時熒光PCR檢測。試驗中能夠檢出液體樣品中的VTEC細菌數量可達10cfu/mL。試驗結果表明建立的SYBR Green I實時熒光PCR方法的特異性、敏感性、重復性均達到試驗設計要求。 試驗二VTEC多重熒光PCR法在VTEC快速檢測中的應用應用試驗一建立的方法檢測樣品，樣品來源有兩部分，一部分是模擬陽性樣品，