磁性富集熒光法快速檢測大腸桿菌的研究.pdf

1、隨著全球工業(yè)的發(fā)展，環(huán)境污染和食品安全問題日趨嚴(yán)重。環(huán)境保護(hù)和食品安全已成為本世紀(jì)影響人類生存和發(fā)展的重要問題。腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic escherichia coli，EHEC)是人類食源性以及水源性病原體，食用被該菌污染的食物會(huì)導(dǎo)致腹瀉和腸炎，嚴(yán)重時(shí)將導(dǎo)致出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒癥綜合癥，甚至死亡。EHEC以大腸桿菌O157∶H7血清型為代表菌株，呈暴發(fā)流行趨勢(shì)，且不斷發(fā)生變異。建立一種快速、準(zhǔn)確、簡便

2、檢測大腸桿菌的方法，對(duì)環(huán)境監(jiān)測和臨床醫(yī)學(xué)流行病學(xué)診斷有現(xiàn)實(shí)意義。因此，為了研究大腸桿菌的高靈敏快速檢測方法，本文建立了一種基于萘酰亞胺標(biāo)記的DNA探針和磁性四氧化三鐵氧化石墨烯分離的大腸桿菌O157∶H7檢測方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在一定條件下，O157∶H7數(shù)量的對(duì)數(shù)值和熒光強(qiáng)度與空白值熒光強(qiáng)度的比值(F/F0)呈線性關(guān)系，線性范圍150～1.5×106CFU/mL，經(jīng)過富集后檢出限可達(dá)100CFU/mL。該方法靈敏度高，檢出限低，耗時(shí)較

3、短，操作簡單，為致病菌的高靈敏檢測提供了新思路。
　　本文將標(biāo)記了萘酰亞胺的ssDNA（單鏈DNA）作為捕獲探針吸附在磁性氧化石墨烯表面，當(dāng)目標(biāo)ssDNA存在時(shí)，捕獲探針與目標(biāo)ssDNA部分雜交，利用磁場將目標(biāo)ssDNA捕獲并進(jìn)行富集，去除原溶液，然后加入釋放探針溶液完成雜交，形成完整雙鏈，使標(biāo)記了熒光的捕獲探針從磁性氧化石墨烯的表面釋放出來，通過測定溶液熒光強(qiáng)度可以實(shí)現(xiàn)大腸桿菌O157∶H7的高靈敏檢測。本文對(duì)合成的目標(biāo)DNAT

4、和培養(yǎng)的大腸桿菌O157∶H7均進(jìn)行了檢測試驗(yàn)，前者用來初步探索實(shí)驗(yàn)的可行性并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，后者作為本實(shí)驗(yàn)體系的應(yīng)用，對(duì)大腸桿菌的檢測進(jìn)行進(jìn)一步的探索。
　　論文研究內(nèi)容和取得的研究成果主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：
　　(1)本實(shí)驗(yàn)合成了水溶性良好、熒光強(qiáng)度穩(wěn)定的N-羥乙基-4-N（氨乙基）-1，8-萘酰亞胺（4-N-aminoethyl-N-hydroxyethyl-1，8-naphthalimide，AHA），并將其作為磁性

5、富集熒光法檢測大腸桿菌的熒光劑，為本實(shí)驗(yàn)測量出良好的熒光信號(hào)強(qiáng)度提供保障。
　　(2)使用熒光分光光度計(jì)定量測量溶液熒光強(qiáng)度，建立檢測大腸桿菌的新體系。以合成目標(biāo)DNA為待測物，對(duì)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，具體包括雜交溫度、雜交時(shí)間、吸附時(shí)間、MGN濃度、釋放探針R濃度和富集倍數(shù)。在最優(yōu)條件下，通過檢測不同濃度待測物存在時(shí)的熒光強(qiáng)度，研究待測物濃度和熒光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系。
　　(3)培養(yǎng)大腸桿菌O157∶H7細(xì)菌溶液，通過平板