流式細胞術檢測牛乳中大腸桿菌數(shù)及細菌總數(shù)的研究.pdf

1、目的：生乳營養(yǎng)物質(zhì)豐富，微生物繁殖速度快。傳統(tǒng)的檢測方法操作繁瑣、耗時長，給企業(yè)的正常生產(chǎn)帶來不便，甚至經(jīng)濟損失。所以要求一種能在短時間內(nèi)檢測出微生物的方法。本課題旨在研究利用流式細胞術快速檢測生乳中的細菌總數(shù)和大腸桿菌兩個微生物指標。 方法：本研究首先建立生乳前處理方法用來排除生乳中大顆粒物質(zhì)對流式細胞儀檢測的干擾；利用PI對全部細菌進行染色，利用熒光抗體ab30522對大腸桿菌進行特異性染色，并對染色條件進行摸索；在流式細胞

2、儀的EXP032 ADC操作系統(tǒng)上建立微生物的檢測程序；利用流式細胞術檢測細菌總數(shù)、大腸桿菌分別與平皿菌落計數(shù)法、MPN法進行比較分析。 結果：研究結果如下： 1．生乳前處理方法：取一定量生乳用300目尼龍膜過濾：取200μl生乳置于EP管中，加蛋白酶K(20mg/ml)5μl、TritonX-100 1μl，50℃消化15min；加800μl 0.1M PBS(pH=7.2)；100℃沸水浴5min 14000g離心5

3、min(或10min)，微量進樣器小心移去脂肪層和上清，保留沉淀(沉淀即細菌)。 注：當檢測乳中總菌數(shù)時熱處理的參數(shù)為100℃沸水浴5min；當檢測乳中大腸桿菌時熱處理的參數(shù)為100℃沸水浴10min。 2．流式細胞術檢測生乳中細菌總數(shù)的檢測流程：生乳前處理；加190μl的0.1MPBS(pH=7.2)重懸沉淀；加PI染液(20μg/ml)10μl，避光染色5min;將樣品移入流式管中，0.1MPBS適當稀釋；利用EXP

4、O32 ADC操作系統(tǒng)進行分析。 3．流式細胞術檢測生乳中大腸桿菌的檢測流程：生乳前處理；用稀釋倍數(shù)為100倍的熒光抗體ab30522 100μl染色20min，0.1M PBS適當稀釋。利用EXP032 ADC操作系統(tǒng)進行分析。 4．流式細胞術檢測生乳中細菌總數(shù)的檢測時間為40min;流式細胞術檢測生乳中大腸桿菌的檢測時間為60min。 5．流式細胞術的最低檢測限為單位體積1個細胞；樣品中細菌濃度的檢測上限是2

5、.4×10<'7>/ml，檢測結果接近2.4×10<'7>/ml的樣品應該適當稀釋再進行檢測。 6．將流式細胞術檢測生乳中細菌總數(shù)與平皿菌落計數(shù)法進行比較，結果表明兩者呈正的直線相關(P<0.01)，相關程度為顯著相關(r=0.9360)；流式細胞術檢測生乳中大腸桿菌和MPN法檢測結果的對數(shù)值具有顯著的相關性(r=0.96，P<0.01，)，兩者擬合的回歸方程為y=1.2443x-1.4718。 結論：流式細胞術能夠極大