單鏈脫氧寡核苷酸介導(dǎo)的低密度脂蛋白受體基因點(diǎn)突變小鼠肝臟原位修復(fù)研究.pdf

1、目的： 低密度脂蛋白受體(LDLR)基因突變可導(dǎo)致家族性高膽固醇血癥(FH).修飾的單鏈脫氧寡核苷酸(MSO)可在基因組的任意位點(diǎn)糾正突變的堿基。本文旨在用反義MSO(A-MSO)對(duì)小鼠在體肝細(xì)胞中的點(diǎn)突變的LDLR基因進(jìn)行原位修復(fù)研究。 方法： 1.HepG2細(xì)胞I,DLR基因無義突變模型原位修復(fù)1.1構(gòu)建并鑒定LDLR-蟲螢光素酶融合蛋白(LDLR-luc)表達(dá)載體將野生型(WT)或660突變型(無義突變)L

2、DLR基因連接到蟲螢光素酶基因(luc)5’端，構(gòu)建pWT-LDLR-luc和p660-LDLR-luc。因660-LDLR基因上存在一個(gè)C到A的點(diǎn)突變，導(dǎo)致一個(gè)無義突變和HinfI酶切位點(diǎn)。DNA測序鑒定質(zhì)粒。 1.2制備和鑒定HepG2細(xì)胞LDLR基因無義突變模型將p660-LDLR-luc瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，檢測轉(zhuǎn)染后48 h HepG2細(xì)胞裂解液的蟲螢光素酶活性(FLA)以鑒定無義突變模型。 1.3 MSO原

3、位修復(fù)HepG2細(xì)胞LDLR基因無義突變反義MSO(A-MSO)或正義MSO(S-MSO)可序列特異地置換堿基導(dǎo)致突變修復(fù)。A-MSO或S-MSO與p660-LDLR-luc共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后72 h檢測HepG2細(xì)胞裂解液的FLA以驗(yàn)證無義突變能否修復(fù)，并篩選出較佳的MSO鏈。 2小鼠在體肝細(xì)胞LDLR基因無義突變模型原位修復(fù)2.1驗(yàn)證水動(dòng)力法的肝靶向性小鼠用水動(dòng)力法轉(zhuǎn)染pWT-LDLR-luc，檢測肝、心、肺、腎和

4、脾組織裂解液的蟲螢光素酶活性(FLA)，以驗(yàn)證水動(dòng)力法的肝靶向性。 2.2制備和鑒定小鼠在體肝細(xì)胞LDLR基因無義突變模型小鼠用水動(dòng)力法轉(zhuǎn)染p660-LDLR-luc，檢測肝FLA和PCR結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析以鑒定小鼠在體肝細(xì)胞LDLR基因無義突變模型。 2.3 MSO肝靶向原位修復(fù)小鼠在體肝細(xì)胞LDLR基因無義突變小鼠水動(dòng)力法轉(zhuǎn)染p660-LDLR-luc 12 h，以多聚乙烯亞(PEI)為

5、載體結(jié)合水動(dòng)力法把MSO輸送到小鼠肝臟。給A-MSO 60 h后，檢測小鼠肝組織裂解液的FLA，以判斷無義突變是否修復(fù)。 2.4 DNA水平驗(yàn)證無義突變修復(fù)PCR-RFLP和DNA測序以驗(yàn)證LDLR基因無義突變是否修復(fù). 結(jié)果： 1.HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)1.1 WT-LDLR和660-LDLR的DNA測序結(jié)果P660-LDLR-luc在LDLR基因上存在一個(gè)C到A的突變(TGA),pWT-LDLR-luc則否。

6、 1.2蟲螢光素酶在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)比較轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞裂解液的FLA。結(jié)果顯示p660-LDLR-luc組比pWT-LDLR-luc低，但比對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pWT-LDLR-EGFP)高，差異顯著(p<0.01)。這表明無義突變可能未完全終止蟲螢光素酶的表達(dá)。 1.3 A-MSO和S-MSO在HepG2細(xì)胞中增強(qiáng)p660-LDLR-1uc表達(dá)蟲螢光素酶比較用p660-LDLR-luc和各種MSO共轉(zhuǎn)染的Hep

7、G2細(xì)胞的FLA，結(jié)果顯示A-MSO和S-MSO均可明顯增強(qiáng)p660-LDLR-luc表達(dá)蟲螢光素酶，且A-MSO較S-MSO強(qiáng)，差異顯著(P<0.01)。 2小鼠實(shí)驗(yàn) 2.1目的質(zhì)粒靶向小鼠肝臟小鼠水動(dòng)力法轉(zhuǎn)染pWT-LDLR-luc后72 h，檢測小鼠肝、心、肺、腎和脾組織裂解液的FLA。結(jié)果顯示小鼠肝組織FLA較高，而肝外組織幾乎檢測不到FLA。這表明水動(dòng)力法轉(zhuǎn)染導(dǎo)致了目的質(zhì)粒的肝特異性轉(zhuǎn)染。 2.2蟲螢光

8、素酶在小鼠肝細(xì)胞中的表達(dá)及PCR-RFLP結(jié)果比較分別轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的小鼠在體肝組織裂解液的FLA。結(jié)果顯示p660-LDLR-luc組比pWT-LDLR-luc組低，但比對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pEGFP-N1)高，差異顯著(p<0.01).這表明無義突變?cè)谛∈蟾闻K中可能未完全終止蟲螢光素酶的表達(dá)。PCR-RFLP分析表明小鼠肝細(xì)胞LDLR基因無義突變未被自動(dòng)修復(fù)。 2.3 A-MSO在小鼠肝細(xì)胞中增強(qiáng)p660-LDLR-luc表達(dá)蟲螢光素

9、酶比較A-MSO組和C-MSO(對(duì)照MSO)組的FLA，結(jié)果表明A-MSO組的FLA明顯高于C-MSO組的FLA(p<0.01). 2.4突變堿基A被置換成堿基CPC-RFLP分析和DNA測序進(jìn)一步表明LDLR基因上的堿基A被置換成C。 結(jié)論： 小鼠水動(dòng)力法轉(zhuǎn)染p660-LDLR-luc可用于制備小鼠在體肝細(xì)胞LDLR基因點(diǎn)突變模型。PEI結(jié)合水動(dòng)力法可使A-MSO有效靶向肝臟。A-MSO可肝內(nèi)原位修復(fù)點(diǎn)突變的L