PEAR技術(shù)制備修飾性寡核苷酸及大腸桿菌移碼突變恢復(fù)相關(guān)研究.pdf

1、人工合成的寡核苷酸在基因調(diào)控方面有重要而廣泛的用途。一些寡核苷酸，例如反義寡核苷酸、CpG寡核苷酸和核酸適配體等已經(jīng)成功應(yīng)用于基因治療上。但是，大量制備寡核苷酸不僅困難而且花費(fèi)特別高。這不僅需要昂貴的合成儀器而且需要繁瑣的純化程序，因?yàn)榛瘜W(xué)合成的寡核苷酸含有大量的錯(cuò)誤序列。之前，本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了一種“聚合酶-內(nèi)切酶擴(kuò)增反應(yīng)”，可以用來制備非修飾性和硫代修飾性寡核苷酸。本文將這種技術(shù)延伸用于制各氟代修飾以及氟硫混合修飾寡核苷酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示

2、，KOD DNA聚合酶和Phusion DNA聚合酶都可以用來擴(kuò)增含有一種或兩種修飾堿基的寡核苷酸，但是KOD DNA聚合酶在擴(kuò)增氟代和氟硫雙代寡核苷酸時(shí)更具優(yōu)勢(shì)。之后用質(zhì)譜檢測(cè)了PEAR產(chǎn)物成分，證明PEAR擴(kuò)增具有極高的準(zhǔn)確性。PEAR產(chǎn)物經(jīng)完全酶切，所有縮短了的產(chǎn)物量非常低(4.8％)，全長(zhǎng)產(chǎn)物比例達(dá)到95.2％，全長(zhǎng)修飾性產(chǎn)物比例達(dá)到89.2％。PEAR反應(yīng)能有效地合成修飾性寡核苷酸。并且擁有諸多優(yōu)點(diǎn)，例如:成本低、無污染、產(chǎn)物

3、純度高、純化簡(jiǎn)單、容易擴(kuò)大規(guī)模。我們相信，這種技術(shù)是一種有用的酶促合成寡核苷酸方法。
　　另外，同源重組不僅在生物進(jìn)化中起重要的作用，而且成為定向改造基因的技術(shù)。據(jù)報(bào)道，微生物可以吸收外界單鏈DNA，并且在體內(nèi)將外界DNA插入到基因組同源區(qū)域內(nèi)，從而造成基因組的定點(diǎn)突變。我們將雙鏈DNA及經(jīng)過化學(xué)修飾的雙鏈DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)時(shí)，預(yù)期遺傳重組的效率可能會(huì)有所提高。為此，我們選取質(zhì)粒pBR322為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)了其β-內(nèi)酰胺酶基因移碼

4、突變體。在外源單鏈野生型寡核苷酸的作用下，移碼突變位點(diǎn)可以被定向修復(fù)，檢測(cè)到少量恢復(fù)突變體。然而，雙鏈寡核苷酸非但沒有提高修復(fù)效率，反而沒有檢測(cè)到恢復(fù)突變體。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在沒有寡核苷酸介導(dǎo)的情況下，移碼突變也可以自發(fā)恢復(fù)。對(duì)回復(fù)突變菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，觀察到其存活率和生長(zhǎng)速率隨著代數(shù)增加而逐漸增長(zhǎng)的現(xiàn)象，移碼突變后讀碼框恢復(fù)不是快速的而是漸進(jìn)式的。對(duì)自發(fā)恢復(fù)的菌株進(jìn)行了測(cè)序分析，結(jié)果顯示，在抗生素的篩選作用下，在移碼突變位點(diǎn)前后不同位置插入