新型聯(lián)合修飾的RNA寡核苷酸在肌肉萎縮疾病治療中的應(yīng)用和研究.pdf

1、FOXO1是FOXO forkhead轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族的一個(gè)成員，它在肌細(xì)胞的分化、代謝和增殖中都起到了重要的作用，能夠顯著的調(diào)節(jié)肌肉生長，尤其是在能量消耗性疾病中起到重要的作用，例如消耗性糖尿病。 本課題擬將直接化學(xué)合成的模擬microRNA的小RNA分子(19-23nt)進(jìn)行2’-O-甲基化和3’末端丁醇基多位點(diǎn)聯(lián)合修飾，以期增強(qiáng)小RNA對靶序列的親和力和對核酸內(nèi)切酶及3’-外切酶的抗性，探索小RNA分子在肌肉萎縮疾病中的治

2、療作用。以FOXO1基因作為抑制的靶位點(diǎn)，在細(xì)胞水平、正常小鼠模型、相關(guān)疾病小鼠模型中選擇能有效抑制FOXO1表達(dá)的小RNA分子，找到并確定能夠進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)的有效地抑制FOXO1基因的小RNA分子，為其臨床治療肌肉萎縮疾病提供理論基礎(chǔ)。 本研究利用新型修飾的寡核苷酸RNA的進(jìn)行體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，它能夠特異性的與目標(biāo)基因FOXO1結(jié)合，顯著抑制FOXO1基因的表達(dá)。主要表現(xiàn)在利用新策略修飾的寡核苷酸RNA在細(xì)胞水平、正常小鼠水

3、平以及疾病小鼠模型水平上都能夠降低FOXO1基因的表達(dá)。另外，Western Blotting和Real-Time PCR的結(jié)果表明，肌肉生長抑制素GDF-8基因和肌肉生長決定因子MyoD的表達(dá)量發(fā)生變化。 首先將一些新型修飾的RNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染肌成纖維細(xì)胞C2C12，篩選得到有效的RNA寡核苷酸后，直接注射700μg的RNA寡核苷酸于正常小鼠模型和疾病小鼠模型S-180，結(jié)果顯示這些新合成的靶向FOXO1的基因能夠被有效的抑制

4、，更為有趣的是，F(xiàn)OXO1的基因被抑制后直接導(dǎo)致了骨骼肌生長的有效增加。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步的顯示，F(xiàn)OXO1是肌肉生長的負(fù)調(diào)控因子。 另外，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯示，抑制螺旋結(jié)構(gòu)的FOXO1的表達(dá)增加肌肉質(zhì)量的同時(shí)，GDF-8基因和MyoD基因在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)都受到了顯著的影響：其中GDF-8基因的表達(dá)得到了顯著抑制，而MyoD的表達(dá)得到了相應(yīng)得增加。將結(jié)果結(jié)合起來綜合分析，可以得知，F(xiàn)OXO1是引起肌肉生長消耗和一些