豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒寡核苷酸芯片的研究與應(yīng)用.pdf

1、豬瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的嚴(yán)重危害我國及世界養(yǎng)豬業(yè)的高度接觸性傳染病,一直是我國養(yǎng)豬業(yè)的頭號(hào)疫病。豬繁殖與呼吸綜合征( Porcine Reproductive and Resratory Syndrome,PRRS)又稱豬藍(lán)耳病,由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive an

2、d Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起,于上世紀(jì)90年代在中國出現(xiàn)并蔓延,2006年暴發(fā)的以Nsp2基因發(fā)生部分缺失變異的美洲型PRRSV為主要病原的高致病性藍(lán)耳病更加重了對我國養(yǎng)豬業(yè)的危害,使豬繁殖與呼吸綜合征與豬瘟一樣成為我國當(dāng)前危害最嚴(yán)重的另一大豬病。因此研究可靠的診斷方法對于有效控制乃至消滅兩種疫病具有重要意義?；蛐酒夹g(shù)是基于核酸分子雜交原理的一種固相雜交技術(shù),即以己知序列的寡核苷酸、cD

3、NA或基因片段作探針,檢測樣品中與其互補(bǔ)的核酸序列,經(jīng)雜交信號(hào)檢測和分析,獲得樣品的基因序列及表達(dá)的信息。
　　本研究的目的是建立檢測美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒并能同時(shí)對高致病性藍(lán)耳病進(jìn)行鑒別診斷的寡核苷酸芯片方法以及豬瘟病毒基因分型寡核苷酸芯片方法,將基因芯片技術(shù)用于兩種疫病的診斷與流行病學(xué)研究。針對PRRSV寡核苷酸芯片方法,本研究的設(shè)計(jì)思路是利用美洲型PRRSV的通用探針及高致病性 PRRSV鑒別探針,通過樣品與芯片探針雜

4、交,在檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的同時(shí)區(qū)分高致病性PRRSV毒株;對于豬瘟病毒基因分型寡核苷酸芯片方法,本研究的設(shè)計(jì)思路是通過比較豬瘟病毒3個(gè)基因群共10個(gè)基因亞群毒株的E2基因序列,設(shè)計(jì)并篩選靈敏度高、與其他亞群樣品無交叉雜交的探針,將熒光標(biāo)記的樣品與芯片雜交來判定樣品中豬瘟病毒所屬的基因亞群。
　　本課題的主要研究結(jié)果如下:
　　1.豬繁殖與呼吸綜合征病毒寡核苷酸芯片檢測方法的建立及應(yīng)用
　　本研究首先從GenB

5、ank數(shù)據(jù)庫下載美洲型PRRSV序列和高致病性PRRSV Nsp2基因缺失變異株序列,通過序列比對,針對美洲型PRRSV基因組ORF6-ORF7的保守序列設(shè)計(jì)美洲型PRRSV毒株的通用PCR引物,在Nsp2基因缺失區(qū)外側(cè)兩端設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段大小不同的缺失株和經(jīng)典株P(guān)CR鑒別引物。根據(jù)PCR擴(kuò)增區(qū)域的序列,以O(shè)lig06.0軟件分別設(shè)計(jì)5條美洲型毒株通用寡核苷酸探針和9條針對經(jīng)典美洲株基因組中相對于高致病性PRRSV Nsp2基因缺失區(qū)序列的

6、探針。探針長度為30nt-35nt,Tm值為85.0-90.9℃。同時(shí)設(shè)計(jì)4條針對增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的芯片雜交陽性對照探針,以一段與目的片段無相似性的植物基因序列作為芯片上探針點(diǎn)的定位探針,以一條隨機(jī)的35nt序列作為芯片雜交的陰性對照探針。本研究共設(shè)計(jì)寡核苷酸探針20條。
　　在芯片制備實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化了點(diǎn)樣緩沖液、點(diǎn)樣探針濃度及探針固定的最佳時(shí)間,

7、確定以博奧生物有限公司生產(chǎn)的基因芯片點(diǎn)樣液作為探針點(diǎn)樣液,最佳點(diǎn)樣探針濃度為50 mol/L,點(diǎn)樣后于室溫固定72小時(shí)探針的固定效果最好。
　　分別以經(jīng)典美洲型PRRSV和高致病性PRRS樣品的cDNA為模板建立了同時(shí)擴(kuò)增美洲型毒株保守序列及Nsp2基因片段的二重PCR熒光標(biāo)記方法。經(jīng)過探針的雜交篩選及雜交緩沖液優(yōu)化,共篩選出4條美洲型毒株通用探針、4條區(qū)分經(jīng)典美洲型毒株與高致病性PRRSV的鑒別探針,建立了豬繁殖與呼吸綜合征病毒

8、芯片檢測方法。芯片的靈敏度和特異性實(shí)驗(yàn)顯示,本方法與常規(guī)的高致病性PRRSV RT-PCR鑒別方法靈敏度相近,芯片探針與豬瘟病毒、豬2型圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病毒等常見豬病毒樣品無非特異性雜交。
　　以建立的寡核苷酸芯片方法對12份臨床疑似樣品進(jìn)行了檢測,在12份樣品中,1份為經(jīng)典美洲型PRRSV陽性,5份為Nsp2基因缺失變異株陽性,6份為PRRSV陰性。同時(shí)用高致病性PRRSV RT-PCR鑒別方法檢測,其結(jié)果與芯片檢測結(jié)果完全一

9、致,顯示了芯片方法的可靠性。
　　由于高敏感性的PCR方法有時(shí)會(huì)發(fā)生非特異性擴(kuò)增,本研究針對兩個(gè)PCR擴(kuò)增片段各設(shè)計(jì)多條探針,通過特異性探針與PCR擴(kuò)增的靶標(biāo)雜交,能夠避免常規(guī)RT-PCR由于非特異性擴(kuò)增而使結(jié)果無法判定的可能性,提高了檢測的特異性。同時(shí),在一張玻片上可點(diǎn)制多個(gè)探針陣列,更適合大量樣品的鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
　　2.豬瘟病毒基因分型寡核苷酸芯片方法的建立及應(yīng)用
　　本研究共收集210條各基因亞群CS

10、FV基因組全長序列、E2基因全長序列及E2基因主要抗原位點(diǎn)編碼區(qū)190nt序列。將所有各基因亞群毒株E2基因190nt的主要抗原位點(diǎn)編碼區(qū)序列用clustalxl.81軟件進(jìn)行多重比對。選取各亞群保守序列,以參考序列正義鏈為模板,按照寡核苷酸探針設(shè)計(jì)原則,用Olig06.0軟件設(shè)計(jì)長度為35nt左右的各基因亞群特異性寡核苷酸探針。為保證各亞群分型探針對于各自基因亞群毒株檢測的特異性,所設(shè)計(jì)的探針與各自對應(yīng)基因亞群毒株序列的錯(cuò)配堿基不超過

11、3個(gè),與其他基因亞群毒株序列錯(cuò)配堿基在3個(gè)以上。實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)各基因亞群探針86條。分別以豬瘟病毒1.1、2.1、2.2、2.3基因亞群樣品的cDNA為模板,以歐盟豬瘟診斷手冊中推薦的CSFV E2基因套式RT-PCRI物擴(kuò)增。以外套PCR產(chǎn)物為模板,在內(nèi)套PCR過程中進(jìn)行Cy3-dCTP摻入熒光標(biāo)記;同時(shí)以合成的豬瘟病毒1.2、1.3、3.1、3.2、3.3及3.4基因亞群E2基因重組質(zhì)粒為模板,以內(nèi)套引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增標(biāo)記,制備芯片雜交

12、樣品。
　　將熒光標(biāo)記的樣品與陽性對照基因(EGFP)混合,與由所有基因分型探針和質(zhì)控探針點(diǎn)制的陣列雜交,比較使用不同雜交緩沖液的雜交效果,確定最佳反應(yīng)條件,在此基礎(chǔ)上剔除與目的基因亞群樣品不雜交或與其他基因亞群樣品產(chǎn)生嚴(yán)重交叉雜交的探針。實(shí)驗(yàn)從86條探針中共篩選出41條雜交信號(hào)較強(qiáng)、特異性好的各基因亞群特異性探針,其中1.1亞群探針5條、1.2亞群6條、1.3亞群2條、2.1亞群4條、2.2亞群4條、2.3亞群2條、3.1亞群5

13、條、3.2亞群4條、3.3亞群5條、3.4亞群4條。
　　以篩選出的各亞群特異性探針及陽性對照基因探針點(diǎn)制陣列,根據(jù)各基因亞群代表樣品與芯片雜交信號(hào)的信噪比(SNR532值)分析,確定SNR>1.6為探針點(diǎn)陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2.2、2.3、3.1、3.3基因亞群樣品與其他亞群個(gè)別探針仍存在微弱交叉雜交,信號(hào)分析結(jié)果表明,非特異性雜交探針點(diǎn)信噪比均接近臨界值,遠(yuǎn)低于特異性探針點(diǎn)的信噪比。相比數(shù)量較多的特異性探針,非特異性探針點(diǎn)

14、數(shù)量少,通過雜交圖譜或信噪比分析仍能準(zhǔn)確鑒別樣品所屬的基因亞群。芯片靈敏度實(shí)驗(yàn)顯示,建立的寡核苷酸芯片方法與本室發(fā)表的豬瘟熒光定量PCR方法的靈敏度相同,均可檢測到10-7稀釋的CSFV Shimen株血毒cDNA。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,探針陣列與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬2型圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病毒樣品無交叉雜交。
　　由于目前國內(nèi)尚無豬瘟病毒1.2、1.3亞群及基因3群毒株流行,受樣品限制,實(shí)驗(yàn)以包括1.1、2.1、2.2、2.3

15、亞群的16份CSF陽性樣品進(jìn)行了芯片檢測驗(yàn)證。結(jié)果顯示,樣品與芯片雜交均呈現(xiàn)各亞群特異的雜交圖譜,從雜交圖譜可以準(zhǔn)確鑒別各樣品所屬的基因亞群。
　　高通量和可用于鑒別診斷的檢測手段對于疫病的診斷和流行病學(xué)研究具有重要意義。目前,以寡核苷酸芯片方法進(jìn)行豬瘟病毒基因分型檢測以及高致病性PRRSV鑒別診斷的研究尚未見報(bào)道。本研究建立的豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒寡核苷酸芯片方法經(jīng)初步應(yīng)用表明,其在高致病性PRRS的鑒別診斷與豬瘟病毒