人白細(xì)胞介素23基因克隆和攜帶EGFP腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、膽管癌是一種高度惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈上升趨勢。多數(shù)膽管癌患者在就診時(shí)已是中晚期，僅有10﹪的患者能接受手術(shù)治療，但手術(shù)切除后的遠(yuǎn)期效果亦不樂觀。文獻(xiàn)報(bào)告，歐美國家膽管癌術(shù)后5年生存率僅為5﹪，13﹪。許多學(xué)者在深入進(jìn)行膽管癌基礎(chǔ)研究，不斷改進(jìn)手術(shù)方法的同時(shí)，積極探索膽管癌的各種綜合治療措施。其中基因免疫治療被認(rèn)為是繼手術(shù)、放療、化療后的第四大腫瘤治療模式而備受關(guān)注。 膽管癌和其他腫瘤一樣，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根本原因在于機(jī)體對腫瘤免

2、疫防預(yù)能力的缺失，即腫瘤的免疫逃避機(jī)制，而免疫逃避的核心在于機(jī)體缺乏對腫瘤抗原的有效遞呈并誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤細(xì)胞多為弱免疫原性，缺乏主要組織相容性復(fù)合體分子、共刺激和粘附分子，因此難以激活機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。近年來，免疫抗腫瘤研究最突出的進(jìn)展之一是對機(jī)體內(nèi)抗原遞呈細(xì)胞(Antigen Presenting Cells,APC)的認(rèn)識，其中樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DC)是目前己知的體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原

3、遞呈細(xì)胞，是機(jī)體免疫應(yīng)答的激發(fā)者，其最大的特點(diǎn)是既能刺激體內(nèi)初始型T細(xì)胞增殖，又能有效地刺激宿主再次應(yīng)答，被稱為機(jī)體免疫系統(tǒng)的“哨兵”。而IL-23作為一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，可增強(qiáng)DC在腫瘤環(huán)境中的生存力和對腫瘤抗原肽的遞呈作用；IL-23還可促進(jìn)活化的T細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞增殖；誘導(dǎo)活化T細(xì)胞和DC產(chǎn)IFN-γ、IL-12等Th1型細(xì)胞因子，這類細(xì)胞因子是介導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞免疫的主要因素。已有動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IL-23自身有顯著抗腫瘤作用。L

4、D等用編碼單鏈IL-23(SCIL-23)的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞系CT26(CT26/scIL-23)，大多數(shù)的荷瘤小鼠腫瘤消退，70﹪的小鼠能完全排斥腫瘤細(xì)胞的再沖擊。 Wang等用表達(dá)P19和P40的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染結(jié)腸未分化腺癌細(xì)胞colon26(colon26/IL-23)，發(fā)現(xiàn)在有免疫活性的小鼠中，colon26瘤生長明顯被抑制，隨后消失。由此可見IL-23是一種潛在的抗腫瘤免疫佐劑，IL-23基因可成為

5、抗腫瘤基因治療的候選基因。 保證IL-23基因在DC中持久高效表達(dá)，選擇合適的轉(zhuǎn)運(yùn)載體十分重要。腺病毒載體是常用的基因轉(zhuǎn)移載體，它具有轉(zhuǎn)染效率高(分裂期與非分裂期細(xì)胞均可感染)；插入外源基因片段長；不整合入宿主細(xì)胞基因組；對機(jī)體毒性小等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于基因治療研究。 本試驗(yàn)擬克隆人白介素23雙亞基因P19和P40，利用Admax法構(gòu)建攜帶hIL-23的復(fù)制缺陷型腺病毒載體，同時(shí)為了監(jiān)控外源基因的表達(dá)，我們引入增強(qiáng)型綠

6、色熒光蛋白(EGFP)，研究hII-23在DC中的表達(dá)及對。DC抗原遞呈作用的影響，為進(jìn)一步轉(zhuǎn)染DC及膽管癌細(xì)胞提供理論和實(shí)驗(yàn)根據(jù)。 目的：分別克隆人IL-23基因的雙亞基P19cDNA和P40cDNA， 構(gòu)建含人IL-23基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體，為轉(zhuǎn)染DC細(xì)胞和構(gòu)建DC疫苗及其介導(dǎo)的治療提供基礎(chǔ)。 方法：設(shè)計(jì)P19探針，從人骨髓細(xì)胞cDNA文庫獲得1個(gè)陽性克隆；從人白血病細(xì)胞K562總RNA中提取P40總RN

7、A，RT-PCR法擴(kuò)增P19和P40基因，酶切及測序鑒定。P19、P40及EGFP經(jīng)IRES序列相連，片斷回收后經(jīng)酶切定向插入腺病毒穿梭質(zhì)粒PDC-316 載體，獲得重組質(zhì)粒pAdTrack-mCMV-P19-IRES-P40-GEFP。通過酶切、PCR．對插入片斷測序鑒定后，將該重組質(zhì)粒和骨架腺病毒載體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，利用．AdMax系統(tǒng)進(jìn)行腺病毒包裝，通過觀察EGFP的表達(dá)及PCR對腺病毒載體進(jìn)行鑒定，利用EGFP及TCI

8、D50法進(jìn)行病毒滴度及感染力分析。 結(jié)果：P19和P40基因經(jīng)測序和GENEBANK中序列完全一致，構(gòu)建的PDC-316-P19-IRES-P40-GEFP經(jīng)酶切得到1387bP的P19-IRES-P40片斷。經(jīng)轉(zhuǎn)染包裝，3天即見綠色熒光蛋白的表達(dá)，11天可見噬斑出現(xiàn)。電鏡下可見在293細(xì)胞中病毒顆粒形成，雙引物酶切鑒定，可擴(kuò)增出特異性片段，而對照ade-EGFP則不能擴(kuò)出目的基因片段。成功構(gòu)建了含人IL-23和EGFP的腺病