草魚(yú)(Ctenopharyngodon idella)白細(xì)胞介素-8的克隆與鑒定.pdf

1、目的：白細(xì)胞介素8(白介素-8/IL-8)是一個(gè)堿基-肝素結(jié)合蛋白，屬于CXC趨化因子，它的主要作用是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)?，F(xiàn)已在多種魚(yú)類(lèi)中克隆到IL-8的基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究。草魚(yú)（Ctenopharyngodon idella）不僅是我國(guó)的主要淡水養(yǎng)殖品種，也是世界第三大養(yǎng)殖品種，但草魚(yú)抗病力差，易受各種致炎因子刺激發(fā)生炎癥乃至死亡，嚴(yán)重影響草魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。本論文擬克隆草魚(yú)IL-8的完整基因，并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行初步鑒定。

2、>　　 方法：首先，運(yùn)用Rapid application of cDNA ends技術(shù)從草魚(yú)中克隆IL-8cDNA全長(zhǎng)序列，并通過(guò)原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a+表達(dá)IL-8融合蛋白。其次，運(yùn)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)健康草魚(yú)血液及12個(gè)組織的IL-8轉(zhuǎn)錄水平：同時(shí)經(jīng)腹腔注射嗜水氣單胞菌后4h，1d,3d，7d檢測(cè)腦、心臟、腸道、中腎、脾臟、頭腎、鰓、胸腺、表皮、尾鰭和肝臟等11個(gè)組織中的IL-8 mRNA相對(duì)變化量。最后，利，

3、用掃描電鏡技術(shù)和石蠟切片技術(shù)觀察4h，1d,3d，7d時(shí)草魚(yú)腸道結(jié)構(gòu)的變化。
　　 結(jié)果：草魚(yú)IL-8的cDNA全長(zhǎng)序列為609bp，其中包含5’非編碼區(qū)96bp,3’非編碼區(qū)216bp和開(kāi)放閱讀框297bp:其開(kāi)放閱讀框共編碼98個(gè)氨基酸，與人的IL-8相似性為45％，預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)與人的IL-8空間結(jié)構(gòu)極為相似。草魚(yú)IL-8全長(zhǎng)DNA包括四個(gè)外顯子，結(jié)構(gòu)組成與其它物種的IL-8內(nèi)含子外顯子排列相似；利用表達(dá)載體成功誘導(dǎo)表達(dá)I

4、L-8融合蛋白，與預(yù)期大小一致。健康草魚(yú)12個(gè)組織及血液的IL-8轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)結(jié)果顯示，IL-8在各個(gè)組織中都有轉(zhuǎn)錄，其中肝臟中最高，鰭和表皮僅次于肝臟，腸道、中腎、脾臟、頭腎、鰓、胸腺等免疫相關(guān)組織的轉(zhuǎn)錄水平也較高。腹腔注射嗜水氣單胞菌后各組織中IL-8mRNA相對(duì)變化量檢測(cè)結(jié)果顯示，腦和鰭的IL-8無(wú)變化；心臟、腸道、中腎、脾臟、頭腎、鰓、胸腺、表皮和肝臟等9個(gè)組織中的IL-8mRNA分別在4h或1d達(dá)到最高值；其中，免疫相關(guān)組織中

5、表現(xiàn)更為明顯,3d后下降到正常水平。嗜水氣單胞菌感染刺激后草魚(yú)腸道的顯微結(jié)構(gòu)變化表現(xiàn)為，腸道內(nèi)皮細(xì)胞在4h時(shí)有出現(xiàn)空泡變性，1d時(shí)粘膜下層結(jié)締組織充血，細(xì)胞腫脹，固有層淋巴細(xì)胞聚集,3d時(shí)淋巴細(xì)胞多聚集于粘膜下層結(jié)締組織，7d時(shí)腸道組織基本恢復(fù)正常。腸絨毛超微結(jié)構(gòu)顯示，腸道絨毛的破損在3d時(shí)最為明顯，7d時(shí)基本恢復(fù)正常。
　　 結(jié)論：本研究成功克隆并表達(dá)了草魚(yú)完整的炎癥細(xì)胞因子IL-8，該基因在草魚(yú)體內(nèi)呈組成性表達(dá)；致病菌刺激后