番鴨白細(xì)胞介素-6基因的克隆與序列分析.pdf

1、白細(xì)胞介素-6(1L-6)是機(jī)體內(nèi)一種具有多種功能的細(xì)胞因子。IL-6是一種糖蛋白,它是通過(guò)一種受體復(fù)合物而起作用的,此受體復(fù)合物由特殊的IL-6受體蛋白(IL-6R)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)亞單位蛋白gp130(CD130)組成。IL-6可以誘導(dǎo)雙向激酶(JAK)的信號(hào)傳遞活性,進(jìn)而激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT),間接地誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。IL-6有兩個(gè)主要特性:(1)可由多種細(xì)胞產(chǎn)生。正常情況下,骨髓質(zhì)細(xì)胞,T淋巴細(xì)胞,B淋巴細(xì)胞,纖維

2、細(xì)胞等可以產(chǎn)生IL-6,而在局部組織部位,IL-6則主要由成纖維細(xì)胞和巨噬同時(shí),IL-6的產(chǎn)生還受某些刺激物的調(diào)控細(xì)胞產(chǎn)生,但是當(dāng)機(jī)體發(fā)生病變時(shí),單核巨噬細(xì)胞卻是能夠最早產(chǎn)生IL-6的反應(yīng)細(xì)胞；(2)多種刺激均能誘生。炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子、細(xì)菌產(chǎn)物、病毒感染以及三種信號(hào)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(甘油二醛、cAMP和Ca2+激活)任何一個(gè)被激活,均能誘生IL-6。IL-6R以膜受體形式僅在肝細(xì)胞,中性粒細(xì)胞,IL-6具有多種生物學(xué)活性,主要包括調(diào)節(jié)免疫

3、應(yīng)答、誘導(dǎo)急性期蛋白、調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)、調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)等。由于IL-6細(xì)胞因子可以影響抗體的總親和力,而親和力可以顯著影響抗體的生物學(xué)效應(yīng),因此在制備疫苗時(shí),IL-6可能是一種非常重要的天然佐劑。
　　 參考GenBank中發(fā)表的綠頭鴨IL-6(AB191038)基因序列,設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物,以番鴨脾臟中提取的mRNA為模板,用RT-PCR試驗(yàn)方法擴(kuò)增出一條322 bp大小的目的片段。目的產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序,

4、其測(cè)序序列與綠頭鴨(AB191038)同源性為99.7％。分析結(jié)果初步證實(shí)該序列為番鴨IL-6基因序列。在此測(cè)序序列基礎(chǔ)上利用cDNA末端擴(kuò)增技術(shù)(RACE技術(shù))對(duì)序列的兩端進(jìn)行末端擴(kuò)增,分別得到大小為447 bp的3’端未知序列和大小為455 bp的5’端未知序列。將其與已知序列拼接后得到大小為1232 bp的番鴨IL-6 cDNA基因序列,序列的5’端為G-C高富集區(qū),G-C含量高達(dá)80％。與GenBank中發(fā)表的綠頭鴨IL-6(A

5、B191038)基因序列同源性達(dá)90.3％,與原雞(HM179640.1)同源性為81.1％。此番鴨IL-6基因片段包含一個(gè)完整的開放閱讀框,大小為804bp,共編碼267個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。與綠頭鴨IL-6基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列相比,綠頭鴨第37位氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變化:His→Arg(堿性氨基酸)?？臻g結(jié)構(gòu)分析表明,氨基酸位點(diǎn)的變化引起了疏水性以及相應(yīng)的抗原位點(diǎn)均發(fā)生了變化。
　　 根據(jù)RACE試驗(yàn)得到的番鴨IL-6的編碼區(qū)

6、基因序列重新設(shè)計(jì)特異性引物,預(yù)期擴(kuò)增片段大小為804 bp。試驗(yàn)以番鴨脾臟中的mRNA為模板,通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增出699 bp大小的基因片段,測(cè)序后與預(yù)期的基因片段相比,預(yù)期的基因序列中第253-351位核苷酸在克隆后發(fā)生缺失,缺失序列主要位于5’G-C高富集區(qū)。序列分析顯示,測(cè)序序列與綠頭鴨(AB191038)IL-6基因序列的同源性達(dá)90％,與原雞(HM367074.1)IL-6基因序列同源性達(dá)88％,證實(shí)此基因序列來(lái)源于番鴨