逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法將SV40LT基因?qū)胫袊鴮ξr淋巴細(xì)胞的初步研究.pdf

1、近年來由于對蝦病害的威脅，對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到了嚴(yán)重的影響。為了深入研究對蝦病毒和發(fā)展有效的疾病防治策略，建立對蝦細(xì)胞系的要求日益迫切。本文采用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的方法將細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因-猿猴病毒大T抗原基因(SV40LT)導(dǎo)入培養(yǎng)的中國對蝦(Penaeus Chinensis)淋巴細(xì)胞(lymphoid cells)中，嘗試對其進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)。本研究旨在探索對蝦細(xì)胞體外培養(yǎng)的可行技術(shù)，為對蝦細(xì)胞的建系工作奠定基礎(chǔ)。 從攜帶SV40LT

2、基因的質(zhì)粒pLLTSN中高保真PCR擴(kuò)增出2.1 Kb的SV40LT基因，將其插入到泛嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pantropic retroviral vector)pLXRN的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組載體pLXRN-SV40LT。酶切分析和測序驗(yàn)證結(jié)果表明，載體插入基因的位置、大小、序列均正確，成功構(gòu)建重組泛嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLXRN-SV40LT。 采用磷酸鈣沉淀法將重組載體pLXRN-SV40LT與包裝

3、質(zhì)粒pVSV-G共轉(zhuǎn)染GP2-293細(xì)胞，病毒包裝48小時(shí)后收集上清。經(jīng)NIH3T3細(xì)胞測定，重組病毒的滴度為4×10<'6>cfu/ml。 以重組病毒感染原代培養(yǎng)的中國對蝦淋巴細(xì)胞，經(jīng)G418篩選陽性細(xì)胞后傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株具有貼壁能力下降，從壁上脫落的細(xì)胞可懸浮生長等轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征，傳至10代時(shí)，其生長狀態(tài)和分裂勢頭仍很好，而對照細(xì)胞只能傳至3代；轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株傳至12代時(shí)因真菌污染而丟失。 PC

4、R法檢測第10代轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株基因組中的SV40LT基因，結(jié)果表明成功擴(kuò)增出270 bp SV40LT片段，證實(shí)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株基因組中較穩(wěn)定的含有SV40LT基因；采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(TRAP)分析轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的端粒酶活性，聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的端粒酶活性明顯高于原代對照細(xì)胞，這從一個(gè)側(cè)面反映了轉(zhuǎn)基因?qū)ξr細(xì)胞株獲得了轉(zhuǎn)化的特性。 本研究有希望發(fā)展成為建立對蝦永生化細(xì)胞系的可行技術(shù)，同時(shí)為探索其他海洋無脊椎動物