APC蛋白不同功能區(qū)域真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對人結(jié)直腸癌細(xì)胞中β-catenin表達(dá)的影響.pdf

1、近年來的科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，超過90％的結(jié)直腸癌的發(fā)生與經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路的激活密切相關(guān)，該通路異常激活的標(biāo)志是β-catenin的穩(wěn)定和在細(xì)胞核內(nèi)的積聚。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，Wnt/β-catenin信號的激活主要是因APC基因的突變所導(dǎo)致。超過70％的散發(fā)結(jié)直腸癌均存在APC基因突變。大多數(shù)的APC基因體細(xì)胞突變都發(fā)生在密碼子1250至1500間，該區(qū)域的APC突變可導(dǎo)致15氨基酸重復(fù)序列和20氨基酸重復(fù)序列的部分缺失

2、，使其失去正常調(diào)控β-catenin表達(dá)的功能。 多項研究表明，野生型的APC蛋白導(dǎo)入結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)，可以降低β-catenin的表達(dá)水平。然而由于全長的野生型APC片段較大(大于10kb)，直接用于基因治療的操作性較困難。 目的：本研究旨在通過構(gòu)建、驗證含有APC蛋白不同功能區(qū)域的重組真核表達(dá)載體，研究其功能及其對結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá)水平的影響，篩選到既可有效降低β-catenin表達(dá)水平同時片段長度較

3、小的APC基因片段，為將來的基因治療奠定一定的實驗基礎(chǔ)。 方法：1、根據(jù)APC基因的功能結(jié)構(gòu)以及APC突變簇集區(qū)的特點，使用Primer premier5.0軟件設(shè)計7條引物，以含有APC全長cDNA的pBluescript質(zhì)粒為模板，擴增APC基因特異性的功能區(qū)域片段。將擴增出的APC片段克隆到含有優(yōu)化突變型綠色熒光蛋白的pEGFP-N3載體的N端，構(gòu)建含有APC功能區(qū)域的重組真核表達(dá)載體。2、使用ORF查找器對重組質(zhì)粒的測序

4、結(jié)果進(jìn)行分析，將返回的翻譯蛋白序列在線protein BLAST，檢測重組質(zhì)粒表達(dá)APC功能區(qū)域和GFP能否融合表達(dá)。3、使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和HT-29，通過觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況來驗證APC功能區(qū)域在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。4、通過RT-PCR進(jìn)一步驗證重組質(zhì)粒在HT-29中的表達(dá)及轉(zhuǎn)染效率是否與插入片段的大小及細(xì)胞特性密切相關(guān)。5、利用Western blot技術(shù)檢測重組載體對結(jié)直腸癌細(xì)胞中β-c

5、atenin表達(dá)的影響。以β-actin作內(nèi)參，使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS13.0對western blot電泳條帶的灰度值進(jìn)行one-way ANOVA分析。 結(jié)果：擴增了5條APC基因特異性的功能區(qū)域片段。構(gòu)建5個pEGFP-N3-APC結(jié)構(gòu)區(qū)域的重組真核表達(dá)載體：pEGFP-N3-APC1(APC aa6-767)、pEGFP-N3-APC2(APC aa1020-1169)、pEGFP-N3-APC3(APC aa1262-

6、2033)、pEGFP-N3-APC4(APC aa1020-2033)、pEGFP-N3-APC5(APC aa1020-1698)。ORF查找器對重組質(zhì)粒的測序結(jié)果分析，重組質(zhì)粒均可表達(dá)APC功能區(qū)域和GFP的融合蛋白，APC蛋白同源性為99％以上，GFP蛋白同源性為100％。通過觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)驗證APC功能區(qū)域在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，結(jié)果顯示：5個重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞后，細(xì)胞中均可見綠色熒光蛋白的表達(dá)，熒光觀

7、察顯示轉(zhuǎn)染效率分別約為pEGFP-N3一APCI50％、pEGFP-N3一APC250％、pEGFP-N3-APC330％、pEGFP-N3-APC430％、pEGFP-N3-APC550％，空載體pEGFP-N380％，證明重組載體構(gòu)建成功，在細(xì)胞內(nèi)均可表達(dá)相應(yīng)的APC功能區(qū)域。RT-PCR進(jìn)一步驗證重組質(zhì)粒在HT-29中的表達(dá)，RT-PCR結(jié)果顯示，5個重組質(zhì)粒在HCT116和HT-29細(xì)胞中的表達(dá)基本一致。轉(zhuǎn)染效率與插入片段的大小

8、及細(xì)胞特性密切相關(guān)。Western blot技術(shù)檢測重組載體對結(jié)直腸癌細(xì)胞中β-catenin表達(dá)，結(jié)果顯示：在HCT116細(xì)胞中，條帶灰度值間的差異無顯著性(p>0.05)，重組質(zhì)粒對細(xì)胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)無明顯影響。在HT-29細(xì)胞中，前四組條帶(分別是未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-APC1、轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-APC2和轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-APC3的細(xì)胞)灰度值間的差異無顯著性(p>0.05)，而后兩組(轉(zhuǎn)染pEG

9、FP-N3-APC4和轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-APC5的細(xì)胞)的條帶灰度值同前相比，差異有顯著性(p<0.05)。重組質(zhì)粒pEGFP-N3-APC4和pEGFP-N3-APC5轉(zhuǎn)染入HT-29細(xì)胞后可明顯降低細(xì)胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)。pEGFP-N3-APC4和pEGFP-N3-APC5相比較而言，pEGFP-N3-APC5的片段長度相對較小。 結(jié)論：本實驗研究根據(jù)APC基因的功能結(jié)構(gòu)以及APC突變簇集區(qū)的特點，使用Prim

10、er premier5.0軟件設(shè)計7條引物，以含有APC全長cDNA的pBluescript質(zhì)粒為模板，擴增的5條APC基因特異性的功能區(qū)域片段中，經(jīng)構(gòu)建重組、ORF查找器對重組質(zhì)粒的測序、轉(zhuǎn)染、功能證實及Western blot技術(shù)檢測重組載體對結(jié)直腸癌細(xì)胞中β-catenin表達(dá)的影響，證實5個重組載體構(gòu)建成功，在細(xì)胞內(nèi)均可表達(dá)相應(yīng)的APC功能區(qū)域。APC功能區(qū)域在細(xì)胞內(nèi)的成功表達(dá)，為進(jìn)一步研究其在細(xì)胞內(nèi)的功能提供了基礎(chǔ)。在West