慢病毒介導(dǎo)的uPAshRNA抑制絨癌細(xì)胞侵襲能力及機(jī)制的研究.pdf

1、目的:通過(guò)慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)沉默人絨毛膜癌高侵襲力細(xì)胞株JEG-3中uPA基因的表達(dá)，觀察uPA的表達(dá)抑制后VEGF-B、MMP-2基因的表達(dá)變化及對(duì)JEG-3細(xì)胞侵襲能力的抑制作用，揭示uPA、VEGF-B、MMP-2在絨癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制及其關(guān)系，為后續(xù)的以u(píng)PA基因?yàn)榘悬c(diǎn)的絨癌基因治療研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:(1)構(gòu)建靶向人uPA基因的shRNA慢病毒載體(即pLKD-uPA-shRNA)并行PCR鑒

2、定、測(cè)序分析，包裝病毒后測(cè)定病毒滴度。
　　 (2)分別以?xún)H添加等量培養(yǎng)液（空白對(duì)照組）、空載慢病毒（陰性對(duì)照組）、pLKD-uPA-shRNA（干擾組）感染絨毛膜癌高侵襲力細(xì)胞株JEG-3細(xì)胞。
　　 (3)應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative Real-Time PCR）檢測(cè)感染前后uPA、VEGF-B、MMP-2 mRNA表達(dá)量的變化。
　　 (4)Transwell體外侵襲試驗(yàn)檢測(cè)感染前后細(xì)胞侵襲

3、能力的變化。
　　 結(jié)果:(1)經(jīng)陽(yáng)性克隆PCR鑒定及測(cè)序分析顯示能表達(dá)uPA shRNA的慢病毒載體構(gòu)建正確。
　　 (2)包裝慢病毒后，滴度檢測(cè)為7.36×106Tu/ml。
　　 (3) qRT-PCR檢測(cè)顯示:空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、干擾組中uPA mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.025±0.267、0.800±0.099、0.066±0.021，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，干

4、擾組與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (4)qRT-PCR檢測(cè)顯示:空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、干擾組中VEGF-B mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.061±0.410、0.789±0.223、0.061±0.036，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，干擾組與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (5) qRT-PCR檢測(cè)顯示:空白對(duì)

5、照組、陰性對(duì)照組、干擾組中MMP-2mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.009±0.161、0.717±0.222、0.071±0.021，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，干擾組與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (6) Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示:空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、干擾組JEG-3細(xì)胞穿膜數(shù)分別為200.00±11.13、205.00±14.52、61.

6、33±2.08，干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少，與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)慢病毒介導(dǎo)的uPA shRNA可以有效感染JEG-3細(xì)胞并顯著沉默uPA基因的表達(dá)，是一種有效的基因沉默方法之一。
　　 (2)通過(guò)沉默uPA基因的表達(dá)，可以顯著抑制絨癌高侵襲力細(xì)胞株JEG-3的侵襲能力，表明uPA在絨癌