地錢素C誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞死亡及抑制其侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 地錢素C通過ROS介導(dǎo)的DNA損傷促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究
　　一、地錢素C對肺癌的抗腫瘤活性檢測
　　1.地錢素C對肺癌細(xì)胞系的抑制作用:我們選用4種肺癌細(xì)胞系檢測地錢素C的抑制細(xì)胞作用。MTT結(jié)果顯示地錢素C對4種肺癌細(xì)胞系均顯示出良好的抑制作用，半數(shù)致死量在15μM左右。
　　2.地錢素C對荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用:我們通過建立的荷瘤小鼠模型檢測地錢素C的抗腫瘤作用

2、，結(jié)果表明地錢素C可顯著抑制腫瘤體積和大小，顯示出良好的抗腫瘤活性。
　　二、地錢素C誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究
　　1.凋亡相關(guān)蛋白的檢測:Western blot結(jié)果顯示地錢素C可誘導(dǎo)casepase-3的活化和PARP的剪切，證實(shí)了地錢素C誘導(dǎo)肺癌凋亡。時(shí)相蛋白的檢測顯示PARP的剪切出現(xiàn)在12h之后，顯示凋亡并非早期事件。
　　2.ROS與DNA損傷的檢測:我們對地錢素C差異表達(dá)基因芯片進(jìn)行pathway分析，

3、發(fā)現(xiàn)地錢素C可以高度影響DNA損傷與修復(fù)通路。
　　3.Casepase抑制劑的逆轉(zhuǎn)效果檢測:Casepase抑制劑zVAD-fmk僅能部分逆轉(zhuǎn)地錢素C的細(xì)胞毒作用，另一方面，地錢素C誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞出現(xiàn)胞漿空泡化，這種形態(tài)學(xué)變化很難用凋亡來解釋，提示我們除凋亡外還有其他死亡途徑參與其中。
　　第二部分 地錢素C通過抑制蛋白酶體活性和抗微管作用誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞旁凋亡的機(jī)制研究
　　一、自噬與壞死性凋亡在地錢素C誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞死

4、亡的作用
　　1.自噬在地錢素C誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞死亡過程中的作用:我們檢測了自噬相關(guān)基因及相關(guān)通路蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3的表達(dá)在1小時(shí)即明顯上調(diào)，而后持續(xù)上調(diào)。
　　2.壞死性凋亡在地錢素C誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞死亡過程中的作用:壞死性凋亡抑制劑Necrostatin對地錢素C誘導(dǎo)的胞漿空泡化和細(xì)胞死亡均無逆轉(zhuǎn)作用，提示我們壞死性凋亡并非地錢素C誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞死亡的死亡途徑之一。
　　二、地錢素C抑制蛋白酶體活性，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

5、應(yīng)激
　　1.空泡來源的鑒定:我們選用靶向不同細(xì)胞器的熒光探針對其進(jìn)行標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡下可清楚地顯示空泡為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源。而透射電鏡下更加清楚地顯示了地錢素C誘導(dǎo)的A549細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，空泡化的過程。
　　2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的檢測:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹的最常見原因。我們檢測了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。
　　3.蛋白酶體活性的測定:蛋白酶體功能受抑導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑受阻是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的常見原因。我們發(fā)現(xiàn)盡

6、管地錢素C對蛋白酶體各亞基的表達(dá)并無影響，但可顯著抑制肺癌細(xì)胞蛋白酶體的胰蛋白酶樣活性。
　　三、MAPKs不參與地錢素C誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞旁凋亡
　　我們接下來探討與旁凋亡密切相關(guān)的ERK，p38，JNK通路在地錢素C誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞旁凋亡中的作用。
　　四、LC3在地錢素C誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞旁凋亡過程中起重要作用
　　LC3的非自噬性上調(diào)是旁凋亡的一個(gè)共性。通過聯(lián)用放線菌酮和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的干擾實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)MC誘導(dǎo)的持

7、續(xù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是LC3上調(diào)的主要原因，并確定轉(zhuǎn)錄因子ATF4為這一過程的關(guān)鍵分子。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干擾LC3可顯著逆轉(zhuǎn)地錢素C誘導(dǎo)的旁凋亡，提示我們LC3在錢素C誘導(dǎo)旁凋亡過程中起重要作用。
　　五、地錢素C的抗微管作用在誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞旁凋亡的過程中起重要作用mRFP-GFP-LC3腺病毒感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生的膜泡并未運(yùn)輸至溶酶體降解，而芯片結(jié)果顯示地錢素C可顯著抑制兩種微管蛋白的表達(dá)。
　　第三部分 地錢素C通過調(diào)控RG

8、S4表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究
　　一、地錢素C抑制A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移
　　Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)表明地錢素C可顯著減少肺癌細(xì)胞侵襲至下室的細(xì)胞數(shù)目。而劃痕實(shí)驗(yàn)則顯示地錢素C可顯著延緩劃痕愈合的進(jìn)度，以上實(shí)驗(yàn)說明地錢素C誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞死亡的同時(shí)亦可顯著抑制其侵襲轉(zhuǎn)移的能力。
　　二、地錢素C上調(diào)RGS4表達(dá)
　　1.地錢素C對CXCR4與EGFR表達(dá)無影響:為探明地錢素C抑制肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的

9、機(jī)制，我們首先檢測了介導(dǎo)肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的主要膜受體CXCR4與EGFR的表達(dá)。結(jié)果顯示地錢素C對2種受體的表達(dá)并無影響。
　　2.RGS4在肺癌細(xì)胞系中低表達(dá):因CXCR4與EGFR的激活均依賴于G蛋白，我們接下來關(guān)注可以負(fù)調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體的RGS家族。
　　3.地錢素C可顯著上調(diào)RGS4的表達(dá):我們選取了RGS4低表達(dá)的A549細(xì)胞系進(jìn)行研究，結(jié)果顯示盡管地錢素C對RGS4的mRNA表達(dá)水平無明顯影響，但可顯著上調(diào)RGS4

10、蛋白的表達(dá)。
　　三、過表達(dá)RGS4可下調(diào)MMPs，并逆轉(zhuǎn)EMT，顯著抑制A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移
　　1.過表達(dá)RGS4可顯著抑制A549細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力:我們將pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞過表達(dá)RGS4，劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)RGS4可顯著抑制A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力和侵襲能力。
　　2.過表達(dá)RGS4可下調(diào)MMPs并逆轉(zhuǎn)EMT:我們運(yùn)用pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后

11、檢測MMP蛋白與EMT相關(guān)指標(biāo)蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果顯示過表達(dá)RGS4可顯著下調(diào)A549細(xì)胞中MMP2與MMP9的表達(dá);另一方面，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，Vimentin表達(dá)下調(diào)。說明RGS4可通過抑制MMPs，逆轉(zhuǎn)EMT，從而抑制A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　3.過表達(dá)RGS4可阻斷EGFR和CXCR4介導(dǎo)的侵襲轉(zhuǎn)移能力增加:我們將pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞過表達(dá)RGS4，transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)R

12、GS4可完全逆轉(zhuǎn)CXCR4介導(dǎo)的侵襲轉(zhuǎn)移能力增加，可部分逆轉(zhuǎn)EGFR介導(dǎo)的侵襲轉(zhuǎn)移能力增加，這提示我們CXCR4作為G蛋白偶聯(lián)受體，可直接被RGS4負(fù)調(diào)控。
　　四、地錢素C通過RGS4抑制肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移
　　Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)顯示干擾RGS4可以完全逆轉(zhuǎn)地錢素C對肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制效果。同時(shí)western blot結(jié)果顯示干擾RGS4亦可以阻斷MMP2/9的下調(diào)及EMT的逆轉(zhuǎn)，因此，我們得出結(jié)論

13、:地錢素C通過上調(diào)RGS4抑制肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　第四部分 RGS4表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的相關(guān)性研究
　　我們在第三部分中發(fā)現(xiàn)RGS4在肺癌細(xì)胞系與肺正常細(xì)胞系之間存在明顯的表達(dá)差異，而后續(xù)實(shí)驗(yàn)又證實(shí)了RGS4的表達(dá)與肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。
　　一、RGS4在肺癌組織中低表達(dá)
　　我們運(yùn)用免疫組化對121例非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織切片與67例癌旁組織切片中的RGS4表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:41.3％(5

14、0/121)的腫瘤組織中RGS4高表達(dá)，與之相對的，高達(dá)64.2％(43/67)的癌旁組織中RGS4高表達(dá)。
　　二、RGS4表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析
　　我們統(tǒng)計(jì)了121例非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織切片中RGS4的表達(dá)情況及相關(guān)臨床病理指標(biāo)并建立數(shù)據(jù)庫，運(yùn)用卡方檢驗(yàn)檢測RGS4表達(dá)與臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示RGS4表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.009)、TNM分期（P=0.008）顯著相關(guān)。再次印證RGS4與腫瘤

15、侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。
　　三、RGS4表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析
　　1.RGS4表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者5年無病生存率的相關(guān)性分析:我們運(yùn)用Log-rank檢驗(yàn)比較患者生存差別，Cox回歸多因素分析判斷預(yù)后因素是否獨(dú)立，Kaplan-Meier法繪制生存曲線。結(jié)果顯示RGS4低表達(dá)患者其5年無病生存率顯著低于RGS4高表達(dá)患者(P=0.002)，多因素分析顯示RGS4是判定患者5年無病生存率的獨(dú)立因素(P=0.02

16、0)。
　　2.RGS4表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者5年總生存率的相關(guān)性分析:我們運(yùn)用Log-rank檢驗(yàn)比較患者生存差別，Cox回歸多因素分析判斷預(yù)后因素是否獨(dú)立，Kaplan-Meier法繪制生存曲線。結(jié)果顯示RGS4低表達(dá)患者其5年總生存率顯著低于RGS4高表達(dá)患者(P=0.005)，多因素分析顯示RGS4是判定患者5年總生存率的獨(dú)立因素（P=0.041）。
　　第五部分結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn)
　　一、結(jié)論
　　1.地錢素

17、C在體內(nèi)和體外均顯示良好的抗腫瘤活性。
　　2.地錢素C通過誘導(dǎo)ROS聚積和DNA損傷引發(fā)肺癌細(xì)胞凋亡。
　　3.地錢素C通過抑制蛋白酶體活性及抗微管作用誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞旁凋亡。
　　4.地錢素C通過調(diào)控RGS4表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　5.RGS4在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，可作為一個(gè)獨(dú)立的負(fù)相關(guān)因素評價(jià)非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后
　　二、創(chuàng)新點(diǎn)與不足之處
　　1.首次報(bào)道地錢素C誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與ROS聚積和