MiR-124通過(guò)靶向Sp1基因抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移及侵襲的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景及目的：膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)惡性腫瘤，具有很強(qiáng)的侵襲性及高復(fù)發(fā)率、高死亡率等特點(diǎn)，盡管近年來(lái)多種臨床治療方法的改進(jìn)，膠質(zhì)瘤病人預(yù)后和生存情況仍舊很差，對(duì)此有效的新型治療方案的研究對(duì)臨床改進(jìn)非常有必要，例如膠質(zhì)瘤發(fā)病的分子機(jī)制的研究。微小RNA（miRNAs），一類保守的非編碼RNA，負(fù)向調(diào)控人類至少30％的基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平完全或者部分結(jié)合靶向mRNA的3’-UTR區(qū)域，進(jìn)而降低翻譯效能和影響mRNA的穩(wěn)定性。最近研

2、究表明，miRNA作為促癌基因或者抑癌基因，參與腫瘤細(xì)胞多種生物學(xué)過(guò)程，比如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡等。miRNA-124已經(jīng)被證明能夠抑制多種與轉(zhuǎn)移相關(guān)的腫瘤，包括膠質(zhì)瘤，而且文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)miR-124的表達(dá)量在膠質(zhì)瘤中是明顯降低的。Sp1作為一個(gè)研究較透徹的轉(zhuǎn)錄激活因子，通過(guò)結(jié)合靶基因中富含GC的序列，該序列對(duì)下游基因的調(diào)控較為廣泛，比如，和EMT相關(guān)的一個(gè)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin的表達(dá)，間接發(fā)揮調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用。先

3、前研究已經(jīng)指出，Sp1可以聯(lián)合其他復(fù)合物共同激活vimentin的啟動(dòng)子以促進(jìn)其表達(dá)，而且越來(lái)越多的研究表明Sp1通過(guò)調(diào)控涉及腫瘤轉(zhuǎn)移的基因進(jìn)而影響多種類型腫瘤的轉(zhuǎn)移。對(duì)膠質(zhì)瘤而言，先前的研究已經(jīng)表明Sp1在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，并且可以作為一項(xiàng)判斷膠質(zhì)瘤病人預(yù)后的指標(biāo)。考慮到miR-124和Sp1均與轉(zhuǎn)移性腫瘤相關(guān)加上膠質(zhì)瘤浸潤(rùn)特性，結(jié)合生物預(yù)測(cè)軟件，我們猜測(cè)miRNA-124可能通過(guò)靶向Sp1來(lái)調(diào)控膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲。
　　方法：<

4、br>　　1、首先選取U87、U251、A172、OLN93四株細(xì)胞利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）及western blot方法檢測(cè)四株細(xì)胞中的mirR-124和Sp1本底表達(dá)量；
　　2、選用人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、A172作為研究對(duì)象，
　?。?）兩珠細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-124，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）來(lái)檢測(cè)miR-124表達(dá)量以及相對(duì)應(yīng)的Sp1 mRNA表達(dá)量，western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)

5、表達(dá)miR-124后Sp1和vimentin表達(dá)量，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明miR-124靶向結(jié)合Sp1，transwell實(shí)驗(yàn)用來(lái)證明miR-124的生物學(xué)作用；
　?。?）基因敲除方法靶向敲除Sp1基因，分別利用western blot檢測(cè) Sp1和vimentin的表達(dá)，transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步來(lái)確定Sp1的生物學(xué)作用。
　　結(jié)果：qRT-PCR結(jié)果顯示：和正常膠質(zhì)細(xì)胞OLN93相比，miR-124的表達(dá)量在膠質(zhì)

6、瘤細(xì)胞U87，U251，A172細(xì)胞中明顯下調(diào)；膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Sp1在mRNA和蛋白質(zhì)層面上的表達(dá)量均高于正常膠質(zhì)細(xì)胞；U87和A172過(guò)表達(dá)miR-124后，Sp1和vimentin的表達(dá)均下降，同時(shí)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了miR-124靶向結(jié)合Sp1的3‘-UTR區(qū)。敲除Sp1基因后，western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Sp1和vimentin的表達(dá)量下降，同時(shí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力也是下降的。