MiR-21對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U373MG)增殖的影響及其靶位點(diǎn)的確定.pdf

1、目的： microRNA（miRNA）是一類調(diào)控性非編碼短序列RNA片段，是廣泛存在的對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行微調(diào)的分子，參與生命過程中的一系列重要進(jìn)程，有研究表明miRNA可能與腫瘤有潛在的關(guān)系，在不同組織來源的腫瘤細(xì)胞中，miRNA的表達(dá)水平及其調(diào)節(jié)作用是不同的。本研究結(jié)合生物信息學(xué)、基因芯片及報(bào)告基因技術(shù)預(yù)測(cè)和確定miR-21在人類腫瘤細(xì)胞中的靶基因，并對(duì)miR-21通過調(diào)控靶基因而在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮的生物學(xué)功能進(jìn)行進(jìn)一步研究，為理

2、解miR-21在腫瘤形成過程中的作用提供依據(jù)。 方法： 利用脂質(zhì)體法將miR-21、24、190、214四種miRNA的反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）轉(zhuǎn)染至L1373MG細(xì)胞，以gapas control為對(duì)照，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性的變化，并用基因芯片技術(shù)分析比較轉(zhuǎn)染miR-21ASO和gapas control組基因表達(dá)譜的變化。結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)與基因芯片結(jié)果預(yù)測(cè)和篩選m

3、iR-21的靶基因，并構(gòu)建pCDNA3/EGFP-LRRFIP13’UTR載體，并通過檢測(cè)GFP報(bào)告基因的方法進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果： 1.抑制miR-21功能后，MTT法測(cè)得結(jié)果顯示U373MG細(xì)胞活性明顯下降（P（0.05），而抑制miR-24、190、214的功能后，U373MG細(xì)胞活性變化不明顯。 2.基因芯片結(jié)果顯示抑制miR-21功能后，與對(duì)照組相比，mRNA表達(dá)譜有明顯變化，表達(dá)上調(diào)基因有179個(gè)，表達(dá)下

4、調(diào)基因有153個(gè)，這些改變的基因按功能可分為：細(xì)胞因子相關(guān)基因、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、腫瘤相關(guān)基因、凋亡相關(guān)和肝酶代謝相關(guān)基因。 3.從這些基因中，我們根據(jù)功能選取部分基因，采用半定量RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證其中LRRFIP1、SHB、PTK2、FLII、MYLK、HDAC1、AKT1、PTPRF、CDB1、ITGB4、CLU、PPP2R1A，是上調(diào)的，而PDCD5、STK6、GADD45B、YY1則是下調(diào)的，其結(jié)果與基因芯片結(jié)果相符。

5、 4.用利用生物信息學(xué)技術(shù)來預(yù)測(cè)miR-21可能的靶位點(diǎn)，并通過檢測(cè)GFP報(bào)告基因的方法證實(shí)LRRFIP1為靶基因。 結(jié)論： miR-21在U373MG細(xì)胞中作為一種抗凋亡因子，通過轉(zhuǎn)染其反義鏈寡核苷酸特異性抑制其作用后，U373MG細(xì)胞活性明顯下降，基因芯片及半定量RT-PCR結(jié)果顯示一些與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和凋亡相關(guān)的基因上調(diào)/下調(diào)，可能與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞在增殖與凋亡之間達(dá)到一個(gè)新的平衡有關(guān)。預(yù)測(cè)并確定了LRRFIP