Semaphorin3G對人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖的作用研究.pdf

1、目的:研究U251膠質(zhì)瘤細胞中人信號素3G基因(SEMA3G)的表達情況;觀察轉(zhuǎn)染SEMA3G基因?qū)251膠質(zhì)瘤細胞增殖及細胞周期的影響,從而為膠質(zhì)瘤發(fā)生機制提供新的理論依據(jù),為膠質(zhì)瘤的治療提供新的靶點。
　　 方法:
　　 1.分組:實驗設(shè)轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染pEGFP-NI-SEMA3G,SEMA3G-GFP組)、空載體組(轉(zhuǎn)染pEGFP-N1,GFP組)、空白對照組(Control組)。
　　 2.應(yīng)用陽離子脂質(zhì)

2、體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000將外源性的SEMA3G基因?qū)險251膠質(zhì)瘤細胞中。轉(zhuǎn)染后48小時,加入1000μg/ml的遺傳霉素(G418)進行抗性篩選培養(yǎng),每隔3～4天換液一次,維持抗性篩選4周,獲得相對穩(wěn)定表達的克隆株細胞。
　　 3.運用Reverse Transcript-Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)、Western blot(WB)等方法鑒定外源性的SEMA3G基因

3、在細胞中的表達情況。
　　 4.應(yīng)用噻唑蘭(Methylthiazolyl tetrazolium,MTT)法,檢測SEMA3G對U251膠質(zhì)瘤細胞增殖作用的影響。
　　 5.使用流式細胞術(shù)(Flow cytometer,FCM)檢測SEMA3G對U251膠質(zhì)瘤細胞周期的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.SEMA3G-GFP組和GFP組細胞經(jīng)G418抗性篩選14天之后,出現(xiàn)產(chǎn)生抗性的克隆團,倒置熒光顯微鏡下

4、觀察,可見部分細胞帶有綠色熒光標記。
　　 2.RT-PCR、WB方法檢測發(fā)現(xiàn):GFP組和Control組中SEMA3G表達很弱,而SEMA3G-GFP組中SEMA3G基因高表達。
　　 3.MTT法檢測發(fā)現(xiàn):瞬時轉(zhuǎn)染72、96小時和篩選4周后各檢測時間點(24、48、72、96小時)SEMA3G-GFP組細胞的吸光度值(OD值)均低于GFP組和Control組。
　　 4.FCM檢測結(jié)果:SEMA3G基因轉(zhuǎn)染使

5、G1期細胞比例降低,S期比例增高,推測SEMA3G基因主要作用于G1期和S期。
　　 結(jié)論: SEMA3G mRNA在U251膠質(zhì)瘤細胞中的表達很弱,幾乎檢測不到。通過陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染結(jié)合G418篩選的方法,可使U251膠質(zhì)瘤細胞相對穩(wěn)定的表達外源性SEMA3G。SEMA3G可使U251膠質(zhì)瘤細胞G1期細胞比例降低,S期比例增高:且SEMA3G的U25l膠質(zhì)瘤細胞的增殖率下降。故認為SEMA3G基因可影響U251膠質(zhì)瘤細胞周期,