桔梗皂苷-D對(duì)NSCLC細(xì)胞H460和A549的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的80％～85％，其惡性程度較高，5年生存率不到15％。并且，約80～90％的NSCLC患者最終死于肺癌的轉(zhuǎn)移。因此，更有效的抗NSCLC藥物亟需被開(kāi)發(fā)，從而提高患者生存率。近年來(lái)，60％的抗癌新藥直接或間接來(lái)自于天然藥物，尤其是中藥中提取的單體在癌癥的治療和預(yù)防中起到重要作用。中藥桔梗被廣泛地用于中醫(yī)臨床治療各種肺部和呼吸系統(tǒng)疾病。

2、桔梗皂苷-D（Platycodin-D，PD）是從中藥桔梗中提取的一種三萜類(lèi)單體，是桔梗抗癌作用的主要有效成分。前期實(shí)驗(yàn)通過(guò)高通量篩選發(fā)現(xiàn)PD對(duì)NSCLC中的H460和A549細(xì)胞株均具有有效的體外抑制作用。本論文旨在從阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自噬和抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移四個(gè)方面探究PD對(duì)NSCLC細(xì)胞H460和A549的作用機(jī)制，為PD的進(jìn)一步藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。
　　方法:
　　采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖

3、抑制率;Hoechst-33258熒光染色觀(guān)察細(xì)胞核形態(tài)的變化;透射電鏡(TEM)觀(guān)察細(xì)胞超微形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變;流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期分布和早期凋;Annexin-Ⅴ/PI/Hoechst-33258染色結(jié)合高內(nèi)涵(HCS)分析細(xì)胞凋亡;實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中LC3-Ⅱ、MMP-2和MMP-9 mRNA的水平;細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞粘附、遷移和侵襲能力;Western

4、-blot蛋白印跡法分析細(xì)胞周期、線(xiàn)粒體凋亡通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白及MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1.MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，PD有效抑制H460和A549細(xì)胞存活率和增殖，并均呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性。FCM檢測(cè)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，PD作用H460細(xì)胞后，G2/M和S期細(xì)胞分布數(shù)量顯著增加(P＜0.05);PD作用A549細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞分布數(shù)

5、量顯著增加(P＜0.05)。Western-blot進(jìn)一步檢測(cè)PD作用后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H460細(xì)胞中G2/M和S期相關(guān)蛋白Cyclin-E2、CDK2、Cyclin-B1和p-Cdc2的表達(dá)下調(diào)，并且細(xì)胞周期抑制蛋白P27的表達(dá)上調(diào);而在A(yíng)549細(xì)胞中G0/G1期相關(guān)蛋白Cyclin-D1，Cyclin-D3，CDK4和CDK6的表達(dá)下調(diào)，并且細(xì)胞周期抑制蛋白P18的表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，PD抑制細(xì)胞周期下游調(diào)控蛋白E2F

6、1和p-Rb(Ser807和Ser795)表達(dá)。
　　2.Hoechst-33258熒光染色發(fā)現(xiàn)，PD作用后的H460和A549細(xì)胞都出現(xiàn)細(xì)胞核凋亡形態(tài)的改變:細(xì)胞核縮小，核染色質(zhì)碎裂，形成多個(gè)微核，并且，隨著PD濃度的增加，細(xì)胞核凋亡形態(tài)越明顯。FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PD增加了兩種細(xì)胞凋亡率，并呈濃度依賴(lài)性（P＜0.05或P＜0.01）。高內(nèi)涵分析發(fā)現(xiàn)，隨著PD濃度的增加，H460和A549細(xì)胞中Annexin-Ⅴ/PI/Hoeche

7、st-33258的平均熒光密度增加(P＜0.05)，表明PD誘導(dǎo)兩種凋亡并呈濃度依賴(lài)性。Western-blot進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PD通過(guò)上調(diào)Bax、Bim、Caspase-9、cleaved-Caspase-3和PARP的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)誘導(dǎo)H460和A549細(xì)胞線(xiàn)粒體途徑凋亡;同時(shí)，PD抑制Erk信號(hào)通路中Ras、p-c-Raf和p-Erk蛋白的表達(dá)，并且PD誘導(dǎo)H460和A549細(xì)胞凋亡可能與此作用有關(guān)

8、。
　　3.TCM觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，PD作用H460和A549細(xì)胞后，細(xì)胞中出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體。Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PD通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化水平和Atg-3、Atg-7、Beclin-1表達(dá)水平誘導(dǎo)H460和A549細(xì)胞自噬。RT-PCR檢測(cè)自噬金指標(biāo)LC3-Ⅱ在mRNA水平變化，發(fā)現(xiàn)PD上調(diào)了兩種細(xì)胞中LC3-Ⅱ mRNA的表達(dá)(P＜0.05)。進(jìn)一步檢測(cè)PD對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路

9、作用，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞中p-Akt(Ser473)、p-p70S6K(Thr37/46)和p-4EBP1(Thr37/46)的表達(dá)被抑制。并且，通過(guò)使用胰島素(PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活劑)、LY294002（PI3K抑制劑）和雷帕霉素(mTOR抑制劑)進(jìn)一步證明，PD誘導(dǎo)H460和A549細(xì)胞自噬與抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。同時(shí)，檢測(cè)PD對(duì)MAPK信號(hào)通路的作用，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞內(nèi)p-p38MAPK和p-JNK的

10、表達(dá)水平增高，然而，p-Erk1/2的表達(dá)被抑制。并通過(guò)使用U0126(Erk1/2抑制劑)、SP60012（JNK抑制劑）和SB203580(p38MAPK抑制劑)進(jìn)一步證明了PD誘導(dǎo)H460和A549細(xì)胞自噬和激活p-p38MAPK和JNK表達(dá)有關(guān)，而與抑制Erk1/2無(wú)關(guān)。
　　4.PD有效抑制H460和A549細(xì)胞粘附、侵襲和遷移能力，并呈濃度依賴(lài)性(P＜0.05)。PD降低H460和A549細(xì)胞中MMP-2和MMP-9

11、mRNA的表達(dá)(P＜0.01);同時(shí)，PD下調(diào)H460和A549細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)，并抑制其上游Ras、p-c-Raf、 p-Erk1/2和p-Akt的表達(dá)，并呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。
　　結(jié)論:
　　1.PD有效抑制H460和A549細(xì)胞增殖和細(xì)胞活性。并且，PD引發(fā)H460細(xì)胞S和G2/M期周期阻滯和A549細(xì)胞G0/G1期周期阻滯。
　　2.PD通過(guò)線(xiàn)粒體凋亡途徑誘導(dǎo)H460和A549細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)