桔梗皂苷D殺精機(jī)制及初步成藥性研究.pdf

1、背景與目的:
　　人口爆炸已成為全球重大問(wèn)題。在全球范圍內(nèi),每一年有超過(guò)2億個(gè)妊娠發(fā)生,而其中50％是意外妊娠。我國(guó)是人口大國(guó),計(jì)劃生育是我們的基本國(guó)策,避孕藥的研發(fā)一直備受關(guān)注。殺精劑是用于避孕的藥物,在性交前用于陰道以避免妊娠,殺精劑配合其他屏障性避孕措施使用是一種非常有效的避孕措施。目前廣泛使用的殺精劑壬苯醇醚-9(nonoxynol-9,N-9)可能增加艾滋病感染可能性,因而亟需研發(fā)新的殺精劑。中藥是我們的傳統(tǒng)藥物,是藥物

2、研發(fā)的寶貴資源庫(kù),山東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所的前期研究從數(shù)百種單味中藥中已發(fā)現(xiàn)桔梗、遠(yuǎn)志、公丁香具有快速體外殺精子活性,其中桔梗皂苷類提取物的殺精活性最強(qiáng)。有研究顯示來(lái)自植物的天然皂苷類是一類很有發(fā)展前景的體外殺精劑。本研究通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)桔梗中含量最豐富的一種皂苷-桔梗皂苷D(PlatycodinD,PD)具有體外快速殺精子活性,進(jìn)一步通過(guò)與其他數(shù)種皂苷單體比較,證實(shí)PD的體外殺精活性,并通過(guò)精子凋亡檢測(cè)、低滲腫脹實(shí)驗(yàn)、透射及掃描電鏡

3、等探索其殺精機(jī)制,同時(shí)通過(guò)DNA損傷實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)避孕實(shí)驗(yàn)、陰道刺激實(shí)驗(yàn)等初步研究其成藥可能性,以期望獲得具有殺精作用的臨床前候選藥物。
　　方法和結(jié)果:
　　1.伊紅染色檢測(cè)精子活性
　　(遠(yuǎn)志酸或桔梗皂苷D)1μl+伊紅49μl,混勻,取混合液5μl+5μl精液,載玻上混勻,觀察精子著色情況。0.25mmol/L桔梗皂苷D(PD)在瞬間殺滅全部精子(<20s),同樣條件下,遠(yuǎn)志酸(Polygalacicacid,PA)

4、殺滅精子所需濃度為7.5mmol/L。PA有效殺精濃度太高被淘汰,0.2mmol/LPD可有效殺滅精子,作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的作用濃度。
　　2.計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)篩選備選藥物并分析目標(biāo)藥物殺精活性
　　將同一健康男性的精液均分為6份,分別用0.9%NaCl對(duì)照,1%DMSO,0.2mmol/l遠(yuǎn)志皂苷B(OnjisaponinB,OB),0.2mmol/L常春藤皂苷B(HederasaponinB,HB),0.2

5、mmol/L去芹菜糖桔梗皂苷D(DeapioplatycodinD,DPD)處理精子2min。用計(jì)算機(jī)輔助的精液分析系統(tǒng)(CASA)檢測(cè)備選藥物對(duì)人精子的殺傷效果。篩選出PD為活性最強(qiáng)的單體,將同一健康男性的精液均分為4份,分別用0.9%NaCl對(duì)照,0.15mmol/LPD,0.20mmol/LPD,0.20mg/mlN-9(=0.308mmol/L)陽(yáng)性對(duì)照處理2min。CASA檢測(cè)0.15mmol/LPD精子活率(a+b+c%)為

6、47.15±12.44,0.20mmol/LPD精子活率21.38±10.69,0.25mmol/LPD精子瞬間完全失活。得出PD最佳殺精濃度是0.20mmol/LPD,用于后繼實(shí)驗(yàn)。
　　3.殺精機(jī)制研究
　　健康男性的精液上游后,用凋亡試劑盒檢測(cè)PD對(duì)人精子的凋亡誘導(dǎo)作用;用低滲腫脹檢測(cè)試劑盒,LIVE/DEAD?SpermViabilityKit檢測(cè)PD對(duì)人精子細(xì)胞膜的完整性及存活狀態(tài)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.20mmol/

7、LPD引起大量精子發(fā)生晚期凋亡,精子腫脹率下降,LIVE/DEAD檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大量死亡精子;掃描和透射電鏡結(jié)果顯示,精子頭頸處斷裂,精子膜破裂,線粒體腫脹及膜丟失;CometAssay結(jié)果顯示0.20mmol/LPD不會(huì)對(duì)精子DNA造成損傷。
　　3.1精子凋亡檢測(cè):0.10mmol/L,0.15mmol/L,0.20mmol/L,0.25mmol/LPD使大量精子發(fā)生凋亡,以晚期凋亡和壞死(即FITC+PI+)為主;0.25mmol

8、/LPD晚期凋亡及壞死精子比例占精子總數(shù)的75.84±11.12%;各劑量組PD對(duì)精子的早期凋亡(FITC+PI-)均沒(méi)有影響。表明PD破壞了精子膜。
　　3.2低滲腫脹實(shí)驗(yàn):0.9%NaCl對(duì)照組多數(shù)精子發(fā)生了膨脹(尾部卷曲),而PD組精子膨脹不明顯,低滲腫脹反應(yīng)消失,膨脹率從76.5±6.12%下降28.0±6.13%,兩組間膨脹率有顯著差異。結(jié)果顯示精子膜受到PD損傷。
　　3.3LIVE/DEAD?檢測(cè):對(duì)照組精子以

9、綠色熒光(活精子)為主,PD處理后橙色熒光(頻死精子)、紅色熒光(死亡精子)明顯增加,陽(yáng)性對(duì)照組(0.2mmol/LN-9)與0.1mmol/LPD組殺精效果相近,0.2mmol/LPD組精子幾乎都是紅色熒光,殺精率>95%。
　　3.4掃描電鏡及透射電鏡:在掃描電鏡下,對(duì)照組精子形態(tài)正常,頂體清楚,用藥后,可見(jiàn)大量精子頭頸處斷裂。在透射電鏡下,對(duì)照組精子細(xì)胞膜完整,線粒體結(jié)構(gòu)完整。用藥后,精子膜破裂,線粒體腫脹,甚至膜脫落。

10、r>　　3.5CometAssay實(shí)驗(yàn):陰性對(duì)照組,PD0.2mmol/L組的所有實(shí)驗(yàn)用精子,均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)DNA移動(dòng)尾巴,陽(yáng)性對(duì)照組有明顯的DNA移動(dòng)尾巴。
　　4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　4.1避孕實(shí)驗(yàn):雌性SD大鼠右側(cè)子宮注入0.9%NaCl100μl(對(duì)照組),在左側(cè)子宮給予3mg/mlPD100μl(劑量為0.3mg),術(shù)后與雄鼠2:1合籠;第二天發(fā)現(xiàn)陰栓后分籠,10天后處死老鼠,發(fā)現(xiàn)注射PD側(cè)(左側(cè))子宮無(wú)孕囊,而注射生理鹽水

11、側(cè)(右側(cè))子宮正常妊娠。
　　4.2陰道刺激實(shí)驗(yàn):雌性大鼠隨機(jī)分為5組,每天定時(shí)給予0.2ml(約0.5g)PD凝膠陰道局部給藥,連續(xù)給藥14天,末次給藥后處死動(dòng)物,取出陰道組織,用甲醛固定,進(jìn)行組織病理學(xué)檢查及陰道刺激評(píng)分[40]。自然對(duì)照組,空白凝膠組,3mg/gPD組,8mg/gPD組,8mg/gN-9組的陰道刺激評(píng)分分別為2.11±2.01,3.22±1.07,4.89±0.69,7.44±1.58,3.67±1.53。陰