桔梗中皂苷的免疫佐劑活性研究.pdf

1、桔梗為桔?？?Campanulaceae)植物桔梗．Plarvcodon grandiflorum(Jacq)A．DC．的干燥根。本課題應(yīng)用現(xiàn)代色譜分離技術(shù)和免疫學(xué)方法，以溶血性與免疫佐劑活性評(píng)價(jià)為導(dǎo)向，從中藥桔梗中分離出4個(gè)佐劑活性皂苷，采用多種光譜技術(shù)確定了化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過(guò)檢測(cè)這4個(gè)皂苷的溶血性及對(duì)模式抗原卵清蛋白(OVA)的佐劑活性。探討了桔梗酸類(lèi)皂苷溶血性或免疫佐劑活性與化學(xué)結(jié)構(gòu)之間的構(gòu)效關(guān)系；評(píng)價(jià)了桔梗皂苷D(Plarycodi

2、n D，PD)和桔梗皂苷D2(Platycodin D2，PD2)對(duì)重組乙型肝炎表面抗原(recombinant hepatitis B surface antigen，rHBsAg)疫苗的佐劑效應(yīng)和特點(diǎn)，以及Plawcodin D對(duì)商品禽流感新城疫重組二聯(lián)活疫苗的佐劑作用。
　　 1．桔?？傇碥罩忻庖咦魟┗钚猿煞值姆蛛x與鑒定
　　 桔梗藥材以70％乙醇回流提取，醇提取物經(jīng)乙醚脫脂．以水飽和正丁醇萃取及大孔樹(shù)脂純化，得到

3、桔?？傇碥?PGS)。PGS通過(guò)硅膠柱色譜用CHCl3/MeOH洗脫得到4個(gè)流份A、B、C和D，具有佐劑活性的流份C和D經(jīng)過(guò)硅膠柱色譜、Rp—18柱色譜及凝膠柱色譜分離、純化，得到化合物Ⅰ～Ⅳ。根據(jù)ESI—MS、HRESI—MS、4H—NMR、13C—NMR、DEPT、4H—4H COSY、HMOC及HMBC等多種光譜數(shù)據(jù)，這4個(gè)化合物分別鑒定為桔梗皂苷D、D2、D3和PlarvcosideE。
　　 2．四種桔梗皂苷的溶血性和

4、對(duì)OVA的佐劑活性及其構(gòu)效關(guān)系
　　 采用比色法測(cè)定4個(gè)皂苷化合物對(duì)0.5％免紅細(xì)胞的溶血性。根據(jù)引起紅細(xì)胞50％溶血濃度(HD50值)，這4個(gè)皂苷溶血性均顯著低予QuilA(P＜0.001)，溶血性從大到小依次為PD＞PD2＞PD3＞PE(P＜0.01)。
　　 MTT法檢測(cè)了4種桔梗皂苷對(duì)OVA受免小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響。結(jié)果表明：4種皂苷均能促進(jìn)Con A、LPS和OVA誘導(dǎo)的OVA受免小鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(

5、P＜0.05．P＜0.01或P＜0.001)，其中PD的佐劑活性最顯著，PE最弱，PD2和PD3介于二者之間。
　　 采用ELISA檢測(cè)4種桔梗皂苷對(duì)OVA免疫小鼠血清中OVA特異性lgG抗體及抗體亞類(lèi)效價(jià)的影響。PD、PD2、PD3和Alum均能顯著提高OVA免疫小鼠皿清特異性lgG和lgG1效價(jià)(P＜0.01或P＜0.001)，且PD和PD2的佐劑活性顯著優(yōu)于Alum(P＜0.05或P＜0.01)，而PE對(duì)OVA免疫小鼠血清

6、中特異性lgG和lgG1效價(jià)無(wú)顯著性影響。4種皂苷聯(lián)合OVA免疫小鼠血清中特異性IgG2a和IgG2b的效價(jià)也顯著高于OVA墮獨(dú)免疫組．說(shuō)明，這4種皂苷能顯著促進(jìn)OVA免疫小鼠Th1型免疫應(yīng)答。
　　 4．種桔梗皂苷化合物的溶血性和佐劑活性均隨C3位糖鏈的糖基數(shù)增加而降低．同時(shí)，糖基的逛按位置對(duì)溶血性和佐劑活性也有顯著影響。
　　 3．桔梗皂苷PD和PD2對(duì)重組乙型肝炎表面抗原(rHBsAg)疫苗的佐劑作用
　　

7、 PD和PD2分別聯(lián)合rHBsAg免疫小鼠，二免后制備脾細(xì)胞懸液和分離血清．檢測(cè)PD和PD2對(duì)rHBsAg免疫小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答的影響評(píng)價(jià)。淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PD和PD2可顯著增強(qiáng)免疫小鼠T、B淋巴細(xì)胞對(duì)rHBsAg的免疫應(yīng)答能力(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)。PD和PD2不僅能顯著提高免疫小鼠血清中HBsAg特異性IgG抗體及其IgG1、IgG2a和IgG2b亞類(lèi)抗體的效價(jià)(P＜0.05，P＜0.01或

8、P＜0.001)，且抗體應(yīng)答的佐劑活性效果顯著優(yōu)于Alum。表明PD和PD2對(duì)rHBsAg免疫小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答均有顯著的佐劑作用。
　　 PD能顯著增強(qiáng)rHBsAg免疫小鼠自然殺傷細(xì)胞(NK)和抗原特異性細(xì)胞毒型T淋巴細(xì)胞(CTL)活性，表明PD可促進(jìn)機(jī)體對(duì)靶細(xì)胞的非特異性和特異性殺傷能力。
　　 熒光定量PCR分析結(jié)果表明PD可增強(qiáng)Th1型細(xì)胞因子IL—2和IFN—γmRNA的表達(dá)(P＜0.001)，從基因調(diào)

9、控角度證實(shí)了PD能促進(jìn)免疫小鼠對(duì)rHBsAg的Th1免疫應(yīng)答，有利于誘導(dǎo)機(jī)體抗病毒細(xì)胞免疫功能。
　　 4．PD對(duì)禽流感新城疫重組二聯(lián)活疫苗的佐劑作用
　　 與單獨(dú)禽流感新城疫重組二聯(lián)活疫苗免疫組對(duì)比，PD不僅能顯著提高免疫小鼠血清中禽流感抗原特異性IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗體效價(jià)，而且能顯著促進(jìn)Con A、LPS和特異性抗原誘導(dǎo)的免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(P＜0.05或P＜0.01)。PD能顯著促進(jìn)免