紫杉醇免疫佐劑作用與機理的初步研究.pdf

1、紫杉醇(Paclitaxel，或Taxol)是一種從紅豆杉(Taxus cuspidate cv.Nana.)中提取和分離出來的天然化合物。由于其對微管的穩(wěn)定作用而抑制細胞進入有絲分裂和低毒性等特點，所以在人醫(yī)臨床上被廣泛用于治療乳腺癌。近年來的研究表明紫杉醇對免疫細胞具有獨特的調節(jié)作用，能引起類似于脂多糖所激發(fā)的天然免疫和特異性免疫反應。因此，我們假設紫杉醇具有免疫佐劑功能，本論文進行紫杉醇免疫佐劑作用的研究并對其佐劑作用機理進行初步

2、探討。
　　 1、紫杉醇免疫佐劑作用研究
　　 目的以卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)作為模式蛋白抗原，研究紫杉醇的佐劑功能，以及對動物免疫平衡的調節(jié)。方法試驗一：將48只ICR小鼠隨機分成6組，生理鹽水組和對照組僅免疫10μg OVA，其他組分別設含紫杉醇50μg、100μg、200μg和200μg鋁膠組。免疫2次，間隔3周。分別采集一免和二免后2周小鼠血清，檢測血清抗OVA抗體IgM、IgG及其亞類。二免后從

3、各組小鼠中分離脾淋巴細胞，采用MTT法檢測淋巴細胞增殖和RT-PCR法檢測OVA刺激后細胞中細胞因子及其相關基因表達。試驗二：將40只ICR小鼠隨機分成5組，對照組僅免疫10μg OVA，其他組分別設含紫杉醇100μg、紫杉醇100μg(凍融)和鋁膠200μg、鋁膠200μg(凍融)組。免疫2次，間隔3周。分別收集一免和二免后2周小鼠血清，間接ELISA法檢測血清抗OVA抗體IgG水平。結果試驗一中在含10μg OVA的抗原中添加100

4、μg紫杉醇能顯著提高小鼠一免和二免后血清中抗OVA特異性IgM和IgG滴度，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3水平，以及淋巴細胞轉化能力(P<0.05)，顯著促進了淋巴細胞合成細胞因子Interleukin-4(IL-4)，Interleukin-10(IL-10)，Interferon-γ(IFN-γ)和Interleukin-12(IL-12)以及促進了GATA-3和T-bet表達(P<0.05)，試驗二中添加100μg紫杉

5、醇疫苗經過凍融后沒有影響到紫杉醇的佐劑效果，而添加200μg鋁膠佐劑組在凍融后明顯降低了其佐劑效果(P<0.05)。表明紫杉醇具有明顯的佐劑作用，并且在調節(jié)Th1/Th2平衡上具有劑量依賴性；紫杉醇與鋁膠佐劑相比，更具有顯著的抗凍能力。
　　 2、體內紫杉醇佐劑作用機理研究
　　 目的以卵清白蛋白OVA作為模式蛋白抗原，研究紫杉醇的佐劑功能是否通過Hsp90(Heat shock protein90)，細胞微管蛋白(β-

6、tubulin)和TLR4(Toll-likereceptor4)介導。方法試驗一：將24只TLR4基因突變小鼠C3H/HeJ(TLR4-/-)和24只TLR4基因正常對照小鼠C3H/HeB(TLR4+/+)分別隨機分成4組，每組6只。對照組僅免疫10μg OVA，其他組分別設含紫杉醇100μg和25μg LPS組。免疫2次，間隔3周。分別收集一免和二免后2周小鼠血清，檢測血清抗OVA抗體IgM、IgG滴度。試驗二：將40只ICR小鼠隨

7、機分成5組，每組8只。對照組僅免疫10μg OVA，其他組分別設含單獨紫杉醇100μg組和50μg格爾德霉素(Geldanamycin)組，以及100μg紫杉醇+50μg格爾德霉素組。在免疫后的第二周從小鼠眼靜脈叢采血，檢測血清抗OVA抗體IgM、IgG水平。試驗三：將40只ICR小鼠隨機分成5組，每組8只。對照組僅免疫10μg OVA，其他組分別設含單獨紫杉醇100μg組和20μg秋水仙堿(Colchicine)組，以及100μg紫杉

8、醇+20μg秋水仙堿組。在免疫后的第二周從小鼠眼靜脈叢采血，檢測血清抗OVA抗體IgM、IgG水平。試驗四：將40只ICR小鼠隨機分成5組，每組8只。對照組僅免疫10μg OVA，其他組分別設含單獨紫杉醇100μg組和50μgpifithrin-a(PFT)組，以及100μg紫杉醇+50μg PFT組。在免疫后的第二周從小鼠眼靜脈叢采血，檢測血清抗OVA抗體IgM、IgG水平。結果試驗一顯示小鼠TLR4受體突變顯著影響到了LPS的佐劑功

9、能(P<0.05)，但沒有影響到紫杉醇的佐劑功能。試驗二顯示向紫杉醇佐劑組中添加格爾德霉素后顯著抑制了紫杉醇增強OVA特異性抗體水平(P<0.05)。試驗三顯示向紫杉醇佐劑組中添加秋水仙堿后顯著提高了紫杉醇增強OVA特異性抗體水平(P<0.05)。試驗四顯示向紫杉醇佐劑組中添加PFT后顯著抑制了紫杉醇增強OVA特異性抗體水平(P<0.05)。
　　 3、體外紫杉醇佐劑作用機理研究
　　 目的體外分析紫杉醇誘導巨噬細胞系N

10、uclear factor kappa B(NF-κB)活化、細胞因子的分泌、共刺激分子表達、調節(jié)天然免疫的MicroRNA表達情況以及對細胞內外熱休克蛋白的影響。方法試驗一：以穩(wěn)轉pNifty-2質粒的RAW264.7細胞為刺激對象，分別向細胞中加入不同終濃度的紫杉醇(0.01、0.1、1、10、100μM)刺激細胞24h，然后從培養(yǎng)基中檢測報告基因SEAP(分泌型堿性磷酸酶)的表達。試驗二：方法同試驗一，采用ELISA法檢測細胞分泌

11、的Tumor necrosisfactor-α(TNF-α)和interleukin-10(IL-10)細胞因子。試驗三：以10μM紫杉醇分別刺激巨噬細胞2h或4h，通過Quantitative Real-time PCR法分析細胞內miR-155，miR-147，miR-146和miR-132分子表達。試驗四：以10μM紫杉醇分別刺激巨噬細胞3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h后，通過Real-time PCR法分析細胞內

12、CD80和CD86分子表達。試驗五：以10μM紫杉醇分別刺激巨噬細胞2h、4h、6h、8h后，通過Western blot分析細胞內外Hsp60，Hsp70和Hsp90及其亞型的表達。結果紫杉醇具有活化巨噬細胞NF-κB的能力(P<0.05)；顯著提高巨噬細胞共刺激分子(CD80與CD86)表達(P<0.05)；促進了巨噬細胞分泌TNF-a和IL-10(P<0.05)；提高了細胞內miR-155，miR-147，miR-146和miR-

13、132分子表達(P<0.05)；促進了巨噬細胞內熱休克蛋白表達和Hsp90-α向細胞內外的釋放。結合上一章的試驗結果，暗示了內源性Hsp90-α介導紫杉醇的佐劑作用。
　　 綜上所述，紫杉醇在體外能上調巨噬細胞共刺激分子的表達，促進前炎性細胞因子的分泌，天然免疫調節(jié)相關的MicroRNA分子的表達，以及細胞內熱休克蛋白的表達和Hsp90-α的釋放；體內研究證明了紫杉醇顯著提高了小鼠對皮下注射OVA抗原的特異性體液免疫水平和細胞免