多西紫杉醇對(duì)H1N1流感疫苗免疫佐劑活性研究及其作用機(jī)理初步探討.pdf

1、我們的前期研究發(fā)現(xiàn)紫杉醇能有效提高機(jī)體對(duì)模式抗原卵清白蛋白(OVA)的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。多西紫杉醇作為紫杉醇的衍生物，具有更好的水溶性和生物學(xué)活性。因此，用多西紫杉醇作為疫苗佐劑具有優(yōu)越性。本研究以H1N1流感病毒裂解疫苗為抗原，小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評(píng)價(jià)多西紫杉醇的佐劑活性，并初步探討其作用機(jī)理。
　　 1.多西紫杉醇通過(guò)皮下注射途徑免疫對(duì)H1N1流感病毒裂解疫苗的佐劑作用。將72只雌性Balb/c小鼠隨機(jī)分成9組(n=8

2、)，分別為生理鹽水組、H1N1抗原組（10ng和100ng HA）、10ng H1N1抗原聯(lián)合25、50、100和200μg多西紫杉醇佐劑組以及200μg鋁膠佐劑組和100μg多西紫杉醇單獨(dú)免疫組。所有小鼠間隔3周皮下免疫兩次，二免后兩周用間接ELISA方法測(cè)定血清特異性IgG、IgG亞類和總IgE，以及HI效價(jià);MTT法測(cè)定脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平;real-time PCR法測(cè)定HA刺激后的脾淋巴細(xì)胞內(nèi)IFN-γ、IL-12、IL-4、I

3、L-10、T-bet和GATA-3mRNA相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果表明多西紫杉醇能顯著促進(jìn)小鼠特異性Th1/Th2型免疫反應(yīng)。當(dāng)10ng抗原與多西紫杉醇聯(lián)合免疫時(shí)，所誘導(dǎo)的IgG、IgG亞類和HI效價(jià)與100ng HA免疫組水平相當(dāng);多西紫杉醇增強(qiáng)了脾淋巴細(xì)胞對(duì)HA抗原、ConA和LPS的刺激反應(yīng)性，上調(diào)細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10）和轉(zhuǎn)錄因子(T-bet、GATA-3)mRNA表達(dá)。另外，多西紫杉醇不會(huì)促進(jìn)IgE的

4、產(chǎn)生，而鋁膠佐劑則顯著高了IgE的水平。
　　 2.多西紫杉醇通過(guò)黏膜免疫途徑對(duì)H1N1流感病毒裂解疫苗的佐劑作用。將40只雌性Balb/c小鼠隨機(jī)分成5組(n=8)，分別為生理鹽水組、2μg H1N1組、2μgH1N1聯(lián)合100μg多西紫杉醇佐劑組、2μg H1N1聯(lián)合5μg rCTB組以及100μg多西紫杉醇單獨(dú)免疫組，各組小鼠間隔2周滴鼻免疫兩次，二免后2周收集腸道組織、血清和黏膜沖洗液等樣品，分別測(cè)定系統(tǒng)免疫和黏膜免疫相

5、關(guān)體液免疫和細(xì)胞免疫指標(biāo)。結(jié)果表明，多西紫杉醇與H1N1流感疫苗混合后免疫小鼠能使動(dòng)物的的全身特異性免疫反應(yīng)（血清IgG、IgA、IgG亞類、HI抗體滴度）和局部黏膜免疫反應(yīng)（鼻、支氣管黏膜沖洗液sIgA，十二指腸黏膜IgA+細(xì)胞、肺組織IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10mRNA表達(dá)、小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)）顯著提高。另外，含多西紫杉醇的疫苗免疫小鼠后能使小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)ConA、LPS和HA刺激反應(yīng)升高。
　　 3.為

6、探討多西紫杉醇佐劑作用機(jī)制，分別從多西紫杉醇對(duì)巨噬細(xì)胞溶酶體、共刺激分子、細(xì)胞因子表達(dá)譜分析、NF-κB活化、基因調(diào)節(jié)功能microRNAs的表達(dá)以及Hsp90表達(dá)等方面的影響進(jìn)行分析。0.01μM多西紫杉醇刺激巨噬細(xì)胞12h后胞內(nèi)溶酶體數(shù)量顯著增加;巨噬細(xì)胞CD80/CD86 mRNA表達(dá)水平隨多西紫杉醇刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高;多西紫杉醇誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌高水平的IL-13、IL-22、IL-2、IL-10、TNF-α, IL-4和I

7、L-17;低劑量多西紫杉醇能在一定程度上激活NF-κB; miR-155、miR-150和miR-146a在多西紫杉醇刺激3h后出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá);體內(nèi)外試驗(yàn)均顯示多西紫杉醇能誘導(dǎo)Hsp90表達(dá)增加。研究結(jié)果提示，多西紫杉醇很可能是通過(guò)增強(qiáng)抗原加工提呈途徑而發(fā)揮其佐劑活性，同時(shí)多西紫杉醇所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子及Hsp90在激發(fā)全身免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而這些效應(yīng)的誘導(dǎo)與NF-κB信號(hào)通路的激活有關(guān)，部分microRNAs在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)

8、揮重要作用。
　　 綜上所述，多西紫杉醇對(duì)H1N1流感裂解疫苗皮下免疫和滴鼻免疫具有佐劑作用。多西紫杉醇和流感裂解疫苗混合注射免疫小鼠可顯著提高小鼠血清特異性抗體水平，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生Th1型（IFN-γ、 IL-12）和Th2型(IL-4、IL-10)細(xì)胞因子，并且不會(huì)導(dǎo)致血清IgE水平上升。多西紫杉醇和流感裂解疫苗混合滴鼻黏膜免疫小鼠可促進(jìn)全身免疫反應(yīng)和局部黏膜免疫反應(yīng)，提高了血清IgG、IgA、IgG亞類、HI效價(jià)顯著升