黏膜免疫佐劑對雞黏膜和系統(tǒng)免疫反應機理的研究.pdf

1、多數傳染病通過消化道和呼吸道傳播，研究與實踐證明消化道黏膜免疫不僅在黏膜局部和其它黏膜組織產生免疫應答，還可引起全身性的體液免疫應答。但是，由于疫苗經過消化道時常受到消化液的降解，在應用中不得不增加了抗原的用量，使其在生產推廣中受到一定的限制。近年來發(fā)現黏膜免疫佐劑能提高黏膜局部和系統(tǒng)的抗體水平，但佐劑種類繁多，作用效果各異，不適于推廣應用。因此研究佐劑的作用特點和作用機理，開發(fā)高效、安全的黏膜免疫佐劑已成為亟待解決的問題。本研究選擇大

2、豆黃酮、CpG DNA、重組IL-2、乳酸桿菌和氟化鈉五種不同類型的黏膜免疫佐劑為研究對象，分別與雞新城疫弱毒苗配合口服免疫雞后，系統(tǒng)研究了它們的免疫增強作用和機理，初步篩選出作用較好的佐劑進行配合，研制了兩種新型復合黏膜免疫佐劑，并對其部分作用機理進行了研究，為口服免疫的推廣和應用提供理論依據。試驗分為以下五章： 1．不同類型黏膜免疫佐劑對雞小腸局部免疫水平和系統(tǒng)免疫的影響 將大豆黃酮、CpG DNA、重組IL-2、乳

3、酸桿菌和氟化鈉五種不同類型的黏膜免疫佐劑，分別與雞新城疫弱毒苗配合口服免疫雞群后，應用組織學、免疫組織化學和免疫血清學方法研究動物黏膜局部和系統(tǒng)免疫水平的變化，初步探討佐劑的作用機理。結果發(fā)現：(1)應用大豆黃酮、CpG DNA和重組IL-2與雞新城疫弱毒苗配合口服免疫雞后，小腸上皮內淋巴細胞(iIEL)的數量從免疫后第五周開始比單獨應用新城疫弱毒苗的明顯增加，到第七周時數量達最多。(2)添加黏膜免疫佐劑可以有效刺激黏膜局部肥大細胞的增

4、加，并且其作用具有時間性。不同類型的黏膜免疫佐劑對肥大細胞的刺激作用也不同。乳酸桿菌對十二指腸肥大細胞的作用明顯，而CpG DNA對空腸中肥大細胞的效果最好，CpG DNA和乳酸桿菌對Peyer’s斑處的肥大細胞作用均明顯高于其它幾種佐劑。(3)大豆黃酮、CpG DNA、重組IL-2和乳酸桿菌在整個免疫期內均可顯著增加各段小腸中IgA分泌細胞數量，其中乳酸桿菌的效果最好，但是維持時間較短。(4)大豆黃酮和CpG DNA兩種佐劑對黏膜局部

5、SIgA水平都有明顯的促進作用，而且持續(xù)作用較長。(5)大豆黃酮、重組IL-2、CpG DNA和氟化鈉四種佐劑都可以顯著提高血清中新城疫特異性抗體水平，增強全身體液免疫力，其中氟化鈉的效果最好。 2．不同類型黏膜免疫佐劑抗原遞呈機制的研究 為了進一步研究黏膜免疫佐劑對局部小腸的免疫機制，應用大鼠腸道原位結扎灌注模型觀察大豆黃酮、CpG DNA和乳酸桿菌三種黏膜免疫佐劑對樹突狀細胞和MHC Ⅱ類分子的影響，研究不同類型的佐

6、劑在小腸黏膜中的抗原遞呈方式。結果發(fā)現：(1)CpG DNA和乳酸桿菌能夠顯著增加小腸樹突狀細胞的數量，刺激樹突狀細胞的活性，促進局部疫苗抗原的遞呈，有效誘導局部黏膜的特異性免疫應答。(2)大豆黃酮、CpG DNA、乳酸桿菌組的大鼠空腸MHC Ⅱ類分子表達量在24小時內顯著增加，表明黏膜免疫佐劑可有效刺激抗原遞呈細胞對抗原的遞呈。提示黏膜免疫佐劑可以增加樹突狀細胞的數量，提高黏膜局部抗原遞呈細胞MHC Ⅱ類分子的表達?？乖f呈細胞的活性

7、增強可以促進局部特異性免疫反應。 3．不同類型黏膜免疫佐劑對核轉錄因子的影響 為了研究黏膜免疫佐劑的信號轉導途徑，應用大鼠腸道原位結扎灌注模型觀察大豆黃酮、CpG DNA和乳酸桿菌三種黏膜免疫佐劑對轉錄因子NF-кB的影響。結果發(fā)現：(1)CpG DNA可以在24小時內顯著增加NF-кB蛋白的表達量，0.25小時作用最明顯。表明在CpG DNA刺激機體后激活NF-кB的轉錄，誘導T、B淋巴細胞的反應，使機體的非特異性免疫

8、能力明顯增強。(2)乳酸桿菌在6小時內可極顯著增加NF-кB蛋白的表達，表明乳酸桿菌刺激機體后也可激活NF-кB途徑。(3)大豆黃酮組NF-кB蛋白的表達不明顯。提示大豆黃酮對機體的刺激信號可能不通過NF-кB途徑激活局部免疫反應。 4．復合黏膜免疫佐劑對雞局部黏膜免疫和系統(tǒng)免疫的作用和機理的研究 根據對不同類型黏膜免疫佐劑免疫效果和作用機制的研究，選擇大豆黃酮、CpG DNA、乳酸桿菌和氟化鈉配制成兩種復合黏膜免疫佐劑

9、：大豆黃酮、乳酸桿菌和氟化鈉配合組成復合佐劑Ⅰ，CpG DNA與氟化鈉配合組成復合佐劑已Ⅱ已。將兩種復合佐劑分別與雞新城疫弱毒苗配合口服免疫雞群后，應用組織學、免疫組織化學、分子生物學和免疫血清學方法觀察動物黏膜局部和系統(tǒng)免疫水平的變化，研究復合佐劑的免疫增強效果和機理。結果發(fā)現：(1)兩種復合黏膜免疫佐劑都能增加局部小腸i IEL、CD3<'+>T細胞和肥大細胞的數量，但對IFN-γ mRNA表達水平影響不大，且在免疫后期IFN-γ

10、mRNA表達水平呈較低趨勢。表明兩種復合佐劑都可以有效提高黏膜局部細胞反應，不同腸段兩者效果有差異，復合佐劑已Ⅱ在空腸效果明顯，維持時間長。(2)兩種復合黏膜免疫佐劑都可以增加小腸局部IgA分泌細胞數量和腸內容物中SIgA抗體水平，但對糞便中SIgA抗體水平影響不明顯。表明兩種復合佐劑都能明顯誘導小腸黏膜局部體液免疫反應，作用維持時間較長，在免疫末期作用仍較明顯。(3)應用復合黏膜免疫佐劑可以顯著增加血清中特異性抗體IgG、IgA的效價

11、，表明復合佐劑與疫苗配合使用后能顯著提高機體的體液免疫功能，其中復合佐劑Ⅱ對抗體的維持時間較長。 5．攻毒保護作用的研究 為了研究復合佐劑在生產實踐中對雞群的免疫保護效果，我們將兩種復合黏膜免疫佐劑分別與新城疫疫苗配合通過口服免疫雞群，當檢測雞群最高抗體效價≤41og2時，用新城疫F<,48>E<,2>強毒株模擬自然經口感染途徑對雞群進行攻擊，探討復合黏膜免疫佐劑應用后對雞群的保護作用。結果發(fā)現：兩種復合黏膜免疫佐劑與新

12、城疫疫苗配合免疫的雞在攻毒后第4天有2只出現輕微神精癥狀，其它正常；攻毒后第7天后全部正常，存活率為100％。單獨應用新城疫弱毒苗免疫的雞在攻毒后第4天死亡3只，存活率50％；攻毒后第5天死亡2只，存活率16.67％；攻毒后第6天全部死亡；對照組的雞在攻毒后第四天全部死亡。表明抗體水平在臨界保護線(≤41og2)時，使用添加復合黏膜免疫佐劑的疫苗免疫，仍然可以有效的保護雞群，抵抗病毒的感染。提示新型復合黏膜免疫佐劑免疫效果和抗感染效果確