不同途徑免疫NDV弱毒苗誘導雞體黏膜和系統免疫反應的研究.pdf

1、雞新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一種急性、敗血性、高度接觸性傳染病，是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的最重要傳染病之一。目前，預防ND雖然有多種有效疫苗，但由于免疫途徑和免疫方法不當等原因，致使雞群發(fā)生ND的現象不斷發(fā)生，對養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展造成了很大的損失。一般認為系統免疫在雞抵抗NDV的感染中發(fā)揮主要作用，但在生產實踐中卻存在著雞體血清抗體水平高仍然發(fā)病

2、的現象，原因何在？有待探索。黏膜免疫是雞體免疫系統產生免疫應答的重要組成部分，對雞體的局部免疫及全身免疫發(fā)揮著重要作用。長期以來，關于NDV弱毒疫苗免疫的研究主要集中于全身系統免疫，而對特異性黏膜免疫的發(fā)生規(guī)律的研究較少，難以全面揭示NDV弱毒疫苗的免疫保護機理。因此，本研究對NDV弱毒苗經不同黏膜途徑免疫雛雞后呼吸道和消化道等局部黏膜特異性抗體和抗體陽性細胞的的發(fā)生規(guī)律進行了全面系統的研究，主要試驗結果如下：
　　 1.雞SI

3、gA的純化及其抗病毒活性
　　 首先應用硫酸銨鹽析和聚乙二醇（PEG）沉淀粗提雞膽汁中的分泌型IgA（SIgA），再經SephadeXG-200凝膠過濾和DEAE纖維素離子交換層析純化SIgA，并用SDS-PAGE電泳和瓊脂擴散試驗檢測其純度和活性，然后采用雞胚接種試驗、雞胚病毒中和試驗和攻毒治療試驗，檢測雞SIgA的抗NDV活性，結果表明，純化的雞SIgA終濃度為3.8mg/mL，重鏈分子量約為67kD，輕鏈分子量約為28kD

4、；SIgA處理NDV后，能明顯降低雞胚尿囊液中NDV的血凝效價，與血清組差異不顯著(P>0.05)；雞SIgA的雞胚病毒中和指數為6.2，低于免疫血清；另外，用純化的SIgA治療攻毒的SPF雞，其治愈率為46.7％，同樣與血清治療組差異不顯著(P>0.05)；試驗結果證明雞SIgA具有一定的中和NDV的能力。
　　 2.不同途徑免疫NDV弱毒苗誘導雞體黏膜和系統免疫發(fā)生規(guī)律的研究
　　 通過建立了檢測NDV特異性抗體的間

5、接ELISA方法,對7日齡SPF雞經不同途徑免疫NDV弱毒苗后的血清、膽汁、呼吸道和消化道分泌液中NDV特異性SIgA、IgG和IgM的消長規(guī)律進行了檢測，同時檢測了血清HI抗體滴度。結果表明，點眼滴鼻免疫和飲水免疫雞的血清、膽汁、呼吸道和消化道分泌液中均可檢測到NDV特異性SIgA、IgG和IgM，其中：IgM在所有樣品中檢出時間最早，大部分于免疫后第3d檢測到，并于第7d達到高峰后迅速下降，是雞體早期抵抗NDV感染的主要抗體；IgG

6、大部分于免疫后第7d檢測到，并于第21d達到高峰，是血清的優(yōu)勢抗體；SIgA大部分于免疫后第7d檢測到，并于第28d達到高峰，在膽汁、呼吸道和消化道分泌液中抗體水平最高，且維持時間最長，是NDV弱毒苗誘導雞膽汁、呼吸道和消化道分泌液中抗NDV的主要抗體。各組免疫雞不僅在誘導部位黏膜分泌液中產生高水平的特異性SIgA、IgG和IgM，而且在遠端黏膜也產生抗體，表明雞的黏膜免疫類似哺乳動物，也具有共同黏膜免疫的特點。點眼滴鼻免疫誘導的血清H

7、I抗體滴度和特異性SIgA、IgG和IgM抗體水平顯著高于飲水免疫，表明點眼滴鼻免疫誘導的系統體液免疫強于飲水免疫。點眼滴鼻免疫在氣管洗液和肺洗液誘導產生的特異性SIgA水平顯著高于飲水免疫，而飲水免疫在消化道洗液中誘導的特異性SIgA水平又顯著高于點眼滴鼻免疫，表明不同免疫途徑在各黏膜效應位點誘導的黏膜免疫反應的強度不同，點眼滴鼻免疫在呼吸道引起的黏膜免疫要強于飲水免疫，而飲水免疫在消化道的免疫強度要高于點眼滴鼻免疫。
　　

8、3．不同途徑免疫NDV弱毒苗誘導雞體黏膜和免疫器官中IgA、IgM和IgG陽性細胞變化規(guī)律的研究
　　 采用常規(guī)石蠟切片技術，優(yōu)化了各種反應條件，建立了檢測免疫器官和局部黏膜IgA、IgM和IgG陽性細胞的間接免疫過氧化物酶組織化學染色法。應用該法，對7日齡經不同途徑免疫NDV弱毒苗的SPF雞脾臟、氣管、十二指腸、空腸、回腸、盲腸扁桃體和直腸中的IgA、IgM和IgG陽性細胞的分布規(guī)律和增殖規(guī)律進行分析。結果顯示，IgA、IgM

9、和IgG陽性細胞呈圓形或卵圓形，被染成深棕黃色，在脾臟中主要分布在邊緣區(qū)及紅髓的髓索中，在氣管中主要分布在氣管粘膜固有膜內和氣管腺之間，在腸管中主要分布在腸絨毛固有層內和腸腺之間。飲水和點眼滴鼻免疫均能誘導雞脾臟、呼吸道和消化道中產生IgA、IgM和IgG陽性細胞，其中脾臟中IgG陽性細胞數量最多，呼吸道和消化道黏膜中IgA陽性細胞數量最多。在免疫后的第21和28d，腸道黏膜固有層中IgA陽性細胞數量顯著多于IgM和IgG陽性細胞。在免

10、疫后第21-28d，點眼滴鼻免疫誘導的脾臟中IgG陽性細胞數量多于飲水免疫，但差異不顯著（P>0.05），而飲水免疫誘導的十二指腸、空腸、回腸和直腸黏膜中IgA陽性細胞數量多于點眼滴鼻免疫，但差異不顯著（P>0.05）。
　　 4.免疫抑制對NDV弱毒苗誘導的雞體黏膜免疫反應的影響
　　 通過摘除法氏囊和注射環(huán)磷酰胺（CY）兩種方法造成1日齡SPF雞的免疫抑制,7日齡時用NDV弱毒苗經飲水免疫試驗雞，于免疫后不同時期檢測

11、各組雞免疫器官相對重量，外周血淋巴細胞數量，血清HI抗體滴度，膽汁、氣管洗液、十二指腸洗液中NDV特異性SIgA水平以及小腸黏膜固有層中IgA陽性細胞的數量，比較兩種免疫抑制方法對系統免疫和黏膜免疫的影響。結果表明，兩種方法均能顯著降低血清HI抗體滴度，引起嚴重的系統體液免疫抑制，其中CY的抑制作用更強；兩種方法亦能顯著降低膽汁、氣管洗液和十二指腸洗液中NDV特異性SIgA抗體水平和小腸黏膜固有層中IgA陽性細胞的數量，特別在免疫后前3

12、周以內抑制作用最明顯，從而也引起較嚴重的局部黏膜免疫反應抑制；另外，NDV強毒攻毒試驗表明局部黏膜免疫在抵抗NDV感染中發(fā)揮了一定的保護作用。
　　 5.免疫增強劑對NDV弱毒苗誘導的雞體黏膜免疫反應的影響
　　 將NDV弱毒苗分別與CpG ODN、黃芪多糖（APS）、左旋咪唑（LMS）混合，并經點眼滴鼻免疫14日齡雛雞，通過檢測免疫后各組雞的血清HI抗體滴度、局部分泌液中的特異性SIgA抗體水平，評價3種免疫增強劑對N

13、DV弱毒苗引起的黏膜和系統體液免疫反應的增強作用。結果表明，在免疫后第3、4周,3種免疫增強劑均能提高血清HI抗體滴度，其中LMS的免疫增強作用強于CpG ODN和APS；3種免疫增強劑亦均能提高氣管洗液、十二指腸洗液、膽汁中NDV特異性SIgA抗體水平，其中CpG ODN序列的免疫增強作用強于APS和LMS；以上試驗結果充分證明了3種免疫增強劑不僅能增強NDV弱毒苗引起的系統體液免疫應答，而且也能較顯著增強黏膜免疫應答反應。綜上所述，