草酰腙縮乙醛酸三環(huán)己基錫酯誘導(dǎo)大細胞肺癌H460細胞凋亡及其機制研究.pdf

1、研究背景和研究目的： 據(jù)WHO統(tǒng)計，肺癌是當今世界上最大的癌患，其死亡率居于各種惡性腫瘤之首位，中國也已成為世界上第一肺癌大國。按組織學(xué)類型可將肺癌分為兩大類：小細胞肺癌和非小細胞肺癌。非小細胞肺癌（NSCLC）占肺癌的85％以上。由于非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移后禁忌手術(shù)，且對放療很不敏感，因此，對非小細胞肺癌化療藥物的開發(fā)與研究尤為重要。 肺癌化療的常用藥物有如下五類：直接破壞DNA藥物、插入DNA模板藥物、影響核酸合成藥物、抑

2、制微管裝配藥物、影響蛋白質(zhì)合成藥物五類。盡管上述藥物可有效誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡，但是毒副作用較大且容易引起耐藥，從而導(dǎo)致化療失敗。因此，開發(fā)毒性小、副作用少、能克服多藥耐藥和有效啟動肺癌細胞凋亡信號傳導(dǎo)途徑的藥物是目前亟待解決的問題。 本研究選用H460、A549、H1792、H226、WI38細胞為實驗細胞研究有機錫小分子化合物抑制NSCLC細胞生長的機制，原因在于：1）此四種NSCLC細胞分別來源于腺癌、大細胞癌、鱗癌，涵蓋了非

3、小細胞肺癌的三種亞型；2）此四種NSCLC細胞均可單獨作為非小細胞肺癌研究領(lǐng)域里的模式細胞，用于細胞水平的檢測；3）迄今對有機錫小分子化合物誘導(dǎo)NSCLC細胞凋亡的機制研究還比較少；4）WI38細胞是從人胚肺組織建立的二倍體成纖維細胞系，作為正常細胞經(jīng)常被用作肺癌研究的對照細胞。因此可用以上細胞系篩選小分子化合物，并對其機制做深入研究，為NSCLC化療藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。 化學(xué)遺傳學(xué)（chemical genetics）是利

4、用化學(xué)工具來研究生物體系的一種新興手段，其可以在以下兩個重要方面促進新藥開發(fā)：一方面是鑒定出在某種疾病形成過程中起重要作用的基因或蛋白質(zhì)，從而為新藥篩選提供靶點；另外一方面是發(fā)現(xiàn)特異性作用于某個基因或蛋白質(zhì)的小分子化合物，從而為新藥開發(fā)提供先導(dǎo)化合物?；瘜W(xué)遺傳學(xué)應(yīng)用的關(guān)鍵之一是要有大量的可供篩選的不同結(jié)構(gòu)的化合物，新興的組合化學(xué)很好地解決了這一難題，在同一個化學(xué)反應(yīng)體系中加入不同結(jié)構(gòu)單元，利用這些結(jié)構(gòu)單元的排列組合，就能夠系統(tǒng)地合成大量

5、化合物。近年來，化學(xué)遺傳學(xué)在細胞凋亡研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用：美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院袁鈞瑛教授帶領(lǐng)課題組進行了“用小分子研究細胞死亡過程中的信號傳導(dǎo)：從Bcl-2到程序性壞死”的研究；美國密執(zhí)安大學(xué)癌癥中心王少萌教授開展了“合理設(shè)計小分子拮抗劑來調(diào)控關(guān)鍵性細胞壞死和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用”的研究；另外，美國國立癌癥研究所（NCI）早在1997年啟動了一項新計劃，將化學(xué)遺傳學(xué)應(yīng)用到癌癥治療研究中，即利用細胞滲透性的小分子化合物觸發(fā)腫瘤細胞

6、死亡。這充分說明化學(xué)遺傳學(xué)方法為細胞凋亡研究提供了一個可靠的平臺，基于此平臺，利用具有一定生物活性的小分子化合物作為研究手段來研究細胞凋亡過程中的信號傳導(dǎo)，優(yōu)勢明顯：小分子化合物易于進入細胞，易于引起細胞表型變化，其作用具有劑量依賴性，適用于多蛋白家族，不會引起細胞的適應(yīng)性變化等，另外，這些小分子化合物還往往可以作為“先導(dǎo)化合物”，進而指導(dǎo)新藥的開發(fā)研究。 近幾年來，本課題組一直在從事有機小分子化合物庫的構(gòu)建工作，目前，庫中已包

7、含了60余種有機錫小分子化合物。研究顯示，某些有機錫化合物具有抗腫瘤活性，這已經(jīng)在MCF-7（乳腺癌）、WiDr（結(jié)腸癌）、P388（小鼠白血?。┑瓤拱┗钚匝芯恐械玫阶C實。這些研究大都停留在生長抑制實驗階段，部分研究顯示有機錫化合物可以阻滯腫瘤細胞周期，但對其抑制生長、誘導(dǎo)凋亡的分子機制仍然不清楚。因此，探討有機錫小分子化合誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡分子機制具有重要意義。 基于以上考量，本課題研究目的是：利用化學(xué)遺傳學(xué)這一新興技術(shù)平臺，以

8、非小細胞肺癌H460、A549、H1792和H226細胞為研究對象，對草酰腙縮乙醛酸三環(huán)己基錫酯（OGTCT）的體外抗腫瘤活性進行研究，進而探討其誘導(dǎo)H460細胞凋亡的分子機制，為新型肺癌化療藥物的開發(fā)提供更加完善的理論依據(jù)。 研究內(nèi)容： 1.鑒定OGTCT對NSCLC細胞、耐藥細胞H460/TaxR及人胚肺二倍體成纖維細胞WB8的生長抑制作用。 2.探討OGTCT對H460細胞的凋亡誘導(dǎo)作用。 3.分析

9、OGTCT對H460細胞周期分布及周期調(diào)控相關(guān)蛋白p53、p21、PCNA表達的影響。 4.分析OGTCT誘導(dǎo)H460細胞凋亡過程中，凋亡相關(guān)調(diào)控因子的變化及重要凋亡通路的激活情況。 研究方法： 1細胞生長抑制檢測： 1.1 MTT法檢測細胞存活率，由此對OGTCT進行初步篩選： 1.2選擇目前臨床上常用抗腫瘤藥物紫杉醇（Paclitaxel）為對照藥物，用MTT法檢測其對腫瘤細胞和正常細胞的生

10、長抑制情況，并與OGTCT做比較。 2.細胞凋亡檢測方法： 2.1倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化及凋亡小體； 2.2 Hoechst33258熒光染色，并結(jié)合熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)變化； 2.3乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒檢測細胞是否出現(xiàn)壞死； 2.4臺盼藍拒染法進一步檢測細胞是否出現(xiàn)壞死； 2.5用Nucleosome ELISA試劑盒檢測細胞凋亡率。 3.細胞周期及其相關(guān)調(diào)控

11、蛋白表達變化的檢測： 3.1流式細胞技術(shù)檢測OGTCT對細胞周期分布的影響； 3.2酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)（ELISA）檢測與細胞周期調(diào)控相關(guān)重要蛋白p53和p21的表達變化； 3.3免疫熒光結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測增殖細胞核抗原PCNA的表達及分布； 3.4 Western blot檢測p53蛋白的表達。 4.熒光探針結(jié)合激光掃描共聚焦技術(shù)檢測細胞中鈣離子濃度變化。 5.檢測OGTCT

12、對ICE家族蛋白酶成員激活情況，方法如下： 5.1用ApoAlert caspase-3，-8比色檢測試劑盒分析caspase-3，-8酶活性變化； 5.2用ApoAlert caspase9/6熒光檢測試劑盒分析caspase-9/6酶活性變化； 5.3用caspase抑制劑檢測caspase-3，8，6，9對OGTCT誘導(dǎo)細胞凋亡的影響。 6.免疫熒光結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測抗凋亡蛋白Bcl-

13、2的分布及表達。 7.Western blot檢測細胞色素C（Cyto-C）的表達變化。 8.酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒檢測Fas/FasL的表達變化。 研究結(jié)果： 1.OGTCT抗腫瘤活性檢測結(jié)果（MTT法檢測細胞存活率）。 2.OGTCT誘導(dǎo)H460細胞凋亡的研究結(jié)果。 2.1倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。 3.OGTCT對H460細胞周期的影響及相關(guān)分子機制研究結(jié)果。

14、 4.OGTCT誘導(dǎo)H460細胞凋亡的相關(guān)分子機制研究結(jié)果。 結(jié)論： 1.OGTCT以濃度依賴的方式，顯著降低NSCLC和H460/TaxR細胞的存活率。OGTCT與紫杉醇相比優(yōu)勢明顯：對正常細胞WI38的毒性極小，且能有效克服腫瘤細胞的多藥耐藥性。 2.OGTCT能有效誘導(dǎo)H460細胞凋亡。OGTCT可能通過上調(diào)p53和p21蛋白水平、降低PCNA表達的方式將細胞周期阻滯于G0/G1期、下調(diào)Bcl-2蛋白表