三種高揮發(fā)性大蒜有機(jī)硫化合物的分析鑒定及其抑制人肺癌細(xì)胞H460增生的機(jī)制研究.pdf

1、大蒜是百合科蔥屬植物生蒜的地下鱗莖，多年的流行病學(xué)研究及臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大蒜具有抗癌防癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血壓降血脂、抗菌和提高機(jī)體免疫力等多種藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜的藥理作用與它含有的揮發(fā)性有機(jī)硫化物成分有密不可分的關(guān)系。大蒜中的有機(jī)硫化物主要是烯丙基硫化物，包括二烯丙基二硫醚(DADS)，二烯丙基硫醚(DAS)等，這些硫化物可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但其作用機(jī)制以及構(gòu)效關(guān)系并不十分清楚。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在多種大蒜制

2、劑中室溫條件下檢測(cè)到的、高含量的高揮發(fā)性有機(jī)硫化合物包括二烯丙基硫醚(DAS)、甲基烯丙基二硫醚(AMDS)以及二烯丙基二硫醚(DADS)，以AMDS含量為最高。為了進(jìn)一步探索這三種大蒜有機(jī)硫化合物作為新型藥物的可行性，本課題首先利用了GC-MS對(duì)人工合成的DADS，AMDS及DAS三種有機(jī)硫化合物進(jìn)行了純度鑒定、雜質(zhì)分析，對(duì)它們?cè)?5℃、4℃及-20℃條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。本課題的第二部分研究?jī)?nèi)容是對(duì)該三種大蒜有機(jī)硫化合物進(jìn)行了肺

3、癌細(xì)胞H460生物學(xué)活性的評(píng)價(jià);構(gòu)效關(guān)系的研究包括該三種有機(jī)硫化合物對(duì)人大細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞的抑制、凋亡、細(xì)胞周期等生物機(jī)制的探索。
　　有機(jī)硫化合物的GC-MS純度檢測(cè)結(jié)果得知DADS、AMDS、DAS的純度分別為98.8％、96.5％、100.0％。雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)構(gòu)表明DADS中的主要雜質(zhì)為DAS(1.2％);而AMDS中的主要雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定為DADS(2.2％)和1-丙烯基甲基二硫醚(MPDS，1.3％)。穩(wěn)定性研究結(jié)果顯

4、示三種有機(jī)硫化合物DADS，AMDS及DAS在25℃條件下均不穩(wěn)定，AMDS尤其不穩(wěn)定，三個(gè)月內(nèi)的純度已經(jīng)下降到50％以下;而三種化合物在-20℃條件下保存三個(gè)月后純度下降都在2％范圍內(nèi)，因此三種化合物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)保存在-20條件下。
　　近年來(lái)，化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及阻滯細(xì)胞周期的機(jī)制研究成為現(xiàn)代抗腫瘤藥物生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。本課題以人大細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞為研究對(duì)象，探索了三種有機(jī)硫化合物對(duì)肺癌H460細(xì)胞的

5、抑制、凋亡、細(xì)胞周期等誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞信號(hào)通路、阻滯細(xì)胞周期的機(jī)制。采用SRB法檢測(cè)了在50-600μM濃度范圍內(nèi)DADS，AMDS及DAS分別作用于H460細(xì)胞24、48、72h后對(duì)細(xì)胞的抑制作用，600μM的DADS在72h對(duì)H460細(xì)胞的最高抑制率為74.8％，600μM的AMDS在72h對(duì)H460細(xì)胞的最高抑制率為65.3％，DAS在600μM范圍內(nèi)對(duì)H460細(xì)胞沒(méi)有抑制作用，三者對(duì)H460細(xì)胞的抑制作用大小順序?yàn)镈ADS＞AMDS

6、＞DAS。使用倒置顯微鏡對(duì)DADS，AMDS及DAS在不同作用濃度和作用時(shí)間下對(duì)H460細(xì)胞形態(tài)的影響進(jìn)行了觀察，研究發(fā)現(xiàn)DADS和AMDS的作用可以使H460細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞收縮變圓，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，圓形細(xì)胞的數(shù)目越來(lái)越多，且細(xì)胞有變大的現(xiàn)象。DAPI染色測(cè)定結(jié)果顯示400μM的DADS和AMDS處理H460細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)凝聚，核固縮等現(xiàn)象，并有典型的凋亡小體產(chǎn)生，DAS即使在600μM范圍內(nèi)也并不能引起H460

7、細(xì)胞產(chǎn)生凋亡小體，由此可知，DADS和AMDS對(duì)H460細(xì)胞的抑制作用是通過(guò)誘導(dǎo)H460細(xì)胞凋亡引起的。FITC-AnnexinⅤ/PI雙熒光染色法測(cè)定結(jié)果表明隨著DADS和AMDS濃度的增加，H460細(xì)胞的凋亡率也隨之增加，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系，而在600μM濃度范圍內(nèi)的DAS不能引起細(xì)胞凋亡。Ellisa試劑盒測(cè)定結(jié)果顯示300μ.M和600μM的DADS和AMDS可以顯著地提高了caspase3、caspase8、caspase

8、9的表達(dá)量，存在劑量依賴(lài)關(guān)系，600μM的DAS則沒(méi)有該作用;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示DADS和AMDS處理組細(xì)胞的線粒體膜電位降低，細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)活性氧的水平升高，600μM的DAS則對(duì)兩者沒(méi)有作用;Westernblotting檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)DADS和AMDS顯著地降低了Bcl-2、Bcl-(X)L蛋白的表達(dá)水平，增加了Bax蛋白的表達(dá)，對(duì)促凋亡分子的細(xì)胞色素C(Cytochromec)的表達(dá)量也有所提高，同時(shí)提高了死亡受體途徑中FADD蛋

9、白的表達(dá)水平;RT-PCR檢測(cè)法進(jìn)一步證實(shí)了DADS和AMDS也可以在mRNA水平上降低Bcl-2的表達(dá)水平，增加Bax的表達(dá)水平，同時(shí)增加了caspase3及FADD的表達(dá)水平，由此說(shuō)明，線粒體途徑與死亡受體途徑同時(shí)參與了H460細(xì)胞的凋亡過(guò)程。PI染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示DADS和AMDS將H460細(xì)胞阻滯于G2/M期，DAS在600μM范圍內(nèi)對(duì)H460細(xì)胞無(wú)周期阻滯作用。Westernblotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DADS和AM

10、DS可顯著地上調(diào)了p53及p21蛋白的表達(dá)量，下調(diào)了PCNA、CyclinB1、CyclinA2蛋白的表達(dá)量，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系。同時(shí)，DADS和AMDS能提高CyclinB1的mRNA水平。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DADS和AMDS顯著地增加了24h后細(xì)胞的劃痕的寬度，而600μM范圍內(nèi)的DAS則對(duì)劃痕寬度無(wú)影響，Westernblotting檢測(cè)數(shù)據(jù)表明DADS和AMDS可以提高E-cadherin黏附蛋白的表達(dá)量。
　　綜上所述，所

11、評(píng)價(jià)的大蒜有機(jī)硫化合物二烯丙基硫醚(DAS)、甲基烯丙基二硫醚(AMDS)、二烯丙基二硫醚(DADS)批次的純度已達(dá)到或接近作為單一藥物的要求，但它們的穩(wěn)定性有待通過(guò)特殊制劑技術(shù)來(lái)進(jìn)一步提高。這三種有機(jī)硫化合物對(duì)肺癌細(xì)胞H460的生物活性研究表明，DADS和AMDS能夠有效地抑制H460細(xì)胞增生，而DAS的抗腫瘤效果非常有限。DADS和AMDS可以將肺癌細(xì)胞H460阻滯于G2/M期，這種細(xì)胞周期阻滯作用與DADS及AMDS上調(diào)p53及p