腺病毒介導(dǎo)syndecan-1過(guò)表達(dá)對(duì)心肌梗死大鼠心室重構(gòu)的影響及機(jī)制探討.pdf

1、心肌梗死(myocardailinfarction，MI)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病)患者嚴(yán)重的心臟事件，其后的心室重構(gòu)可導(dǎo)致心力衰竭、心跳驟停、惡性室性心律失常甚至心源性猝死，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。如何有效防治MI后心室重構(gòu)一直是心血管基礎(chǔ)與臨床研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。近年來(lái)，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑和β受體阻滯劑等多種藥物應(yīng)用于臨床，取得了一定的療效，但仍無(wú)法阻止心室重構(gòu)的發(fā)生。這說(shuō)明影響MI后心室重構(gòu)的因素

2、還有很多。國(guó)外學(xué)者初步研究發(fā)現(xiàn)，粘結(jié)蛋白聚糖-1(Syndedan-1，Sdc1)在心肌損傷修復(fù)過(guò)程中作為炎癥和基質(zhì)重構(gòu)的中心調(diào)節(jié)因子出現(xiàn)，在病理性心室重構(gòu)中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，但具體機(jī)制尚不明確。作為防治心室重構(gòu)的新靶點(diǎn)，明確Sdc1在MI后體內(nèi)表達(dá)的特點(diǎn)，并探討其作用和機(jī)制具有十分重要的意義。 本研究：①以MI大鼠為模型，分時(shí)段定量觀察Sdc1在MI大鼠體內(nèi)表達(dá)的時(shí)間分布特點(diǎn)；②構(gòu)建攜帶大鼠Sdc1cDNA的重組腺病毒載體Ad—

3、CMV—GFP—Sdc1；③在體轉(zhuǎn)染Ad—CMV—GFP—Sdc1，使Sdc1在MI大鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)，觀察其對(duì)膠原合成、心室重構(gòu)和心臟功能的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制，旨在為MI后心室重構(gòu)的防治提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一章Sdc1在MI大鼠體內(nèi)表達(dá)的時(shí)間分布特點(diǎn) 1.1目的:建立MI大鼠模型，定量觀察Sdc1在MI大鼠體內(nèi)表達(dá)的時(shí)間分布特點(diǎn)。 1.2方法: 1.2.1分組：SD大鼠44只，結(jié)扎前降

4、支建立MI大鼠模型。術(shù)后24h存活大鼠隨機(jī)分為MI1天組(MI1d組)、MI3天組(MI3d組)、MI7天組(MI7d組)和MI14天組(MI14d組)。另設(shè)假手術(shù)組。每組n=6。 1.2.2方法：觀察結(jié)束時(shí)處死大鼠，檢測(cè)以下指標(biāo)： 1.2.2.1MI大鼠模型的建立與評(píng)估指標(biāo)：①M(fèi)I面積(HE染色)；②梗死邊緣區(qū)膠原沉積情況(Masson染色)；③心臟功能(超聲心動(dòng)圖和血流動(dòng)力學(xué)檢查)；④心臟重量。 1.2.2.

5、2Sdc1在MI大鼠體內(nèi)表達(dá)的時(shí)間分布特點(diǎn)指標(biāo)：檢測(cè)不同時(shí)間段梗死邊緣區(qū)Sdc1mRNA(RealtimePCR)、蛋白(Westernblot)和血清中可溶性Sdc1(ELISA法)表達(dá)水平。 1.3結(jié)果: 1.3.1MI大鼠模型的建立與評(píng)估：各組大鼠MI面積無(wú)差異(P>0.05)。假手術(shù)組大鼠心肌膠原纖維少，心臟各室壁厚度正常，運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)。MI14d組大鼠梗死邊緣區(qū)膠原纖維增加，左室前壁變薄，室壁運(yùn)動(dòng)減弱或消失，心臟功

6、能下降(P<0.01)，心室重量增加(P<0.01)。 1.3.2Sdc1在MI大鼠體內(nèi)表達(dá)的時(shí)間分布特點(diǎn)：假手術(shù)組大鼠心肌Sdc1mRNA和蛋白表達(dá)量低，血清中可溶性Sdc1水平低。MI術(shù)后大鼠梗死邊緣區(qū)Sdc1mRNA和蛋白表達(dá)逐漸增加，血清中可溶性Sdc1水平逐漸升高，三者均在第3天達(dá)到高峰，此后逐漸下降，各組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 1.3.3Pearson相關(guān)分析顯示：MI大鼠血清中可溶性Sdc1

7、水平與梗死邊緣區(qū)心肌組織Sdc1蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.952，n=30，t=16.533，P<0.01)。 1.4小結(jié): 1.4.1采用結(jié)扎前降支法成功建立MI大鼠模型，模型的可重復(fù)性和均一性良好。 1.4.2基礎(chǔ)狀態(tài)下，大鼠心肌可檢測(cè)到Sdc1mRNA和蛋白表達(dá)，血清中存在可溶性Sdc1，三者表達(dá)水平均較低。MI大鼠梗死邊緣區(qū)Sdc1mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，血清中可溶性Sdc1水平顯著升高，三者均在

8、第3天達(dá)到高峰，此后逐漸下降，呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。 1.4.3MI大鼠血清中可溶性Sdc1水平與梗死邊緣區(qū)心肌組織Sdc1蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)。 第二章重組腺病毒載體Ad—CMV—GFP—Sdc1的構(gòu)建 2.1目的:構(gòu)建攜帶大鼠Sdc1cDNA的重組腺病毒載體Ad—CMV—GFP—Sdc1。 2.2方法: 采用基因重組技術(shù)和改良的體外連接法構(gòu)建重組腺病毒載體Ad—CMV—GFP—Sdc1；在293細(xì)胞中

9、擴(kuò)增，CsCl梯度離心純化，以基因測(cè)序、酶切及PCR法進(jìn)行鑒定，用TCID50法測(cè)定病毒的生物活性。 2.3結(jié)果: 基因測(cè)序顯示質(zhì)粒pCMV—Sport6.1-Sdc1正確攜帶大鼠Sdc1基因。酶切結(jié)果顯示成功構(gòu)建出重組穿梭質(zhì)粒和重組腺病毒質(zhì)粒。PCR證實(shí)重組腺病毒攜帶Sdc1基因片段，提示Ad—CMV—GFP—Sdc1構(gòu)建成功。TCID50法測(cè)得重組腺病毒生物活性為2×1011PFU/mL。 2.4小結(jié):

10、 采用基因重組技術(shù)和改良的體外連接法成功構(gòu)建出攜帶大鼠Sdc1基因的重組腺病毒載體Ad—CMV—GFP—Sdc1，經(jīng)擴(kuò)增和純化，獲得重組腺病毒生物活性為2×1011PFU/mL。 第三章Sdc1過(guò)表達(dá)對(duì)MI大鼠心室重構(gòu)的影響及機(jī)制探討 3.1目的:在體轉(zhuǎn)染Ad—CMV—GFP—Sdc1，觀察Sdc1過(guò)表達(dá)對(duì)MI大鼠心室重構(gòu)和心臟功能的影響并探討其可能的作用機(jī)制。 3.2方法: 3.2.1分組：SD大鼠4

11、8只，結(jié)扎前降支術(shù)后即刻，在梗死邊緣區(qū)行心肌內(nèi)注射。根據(jù)注射內(nèi)容物的不同分組：①M(fèi)IAd—CMV—GFP—Sdc1轉(zhuǎn)染組(n=8，注射Ad—CMV—GFP—Sdc1)；②MIAd—GFP對(duì)照組(n=8，注射Ad—GFP)；③MI鹽水組(n=8，注射生理鹽水)；④假手術(shù)組(n=6)。 3.2.2方法：重組腺病毒轉(zhuǎn)染術(shù)后14天處死大鼠，檢測(cè)以下指標(biāo)： 3.2.2.1重組腺病毒轉(zhuǎn)染與鑒定的指標(biāo)：①注射點(diǎn)腺病毒的表達(dá)(觀察綠色熒

12、光)；②梗死邊緣區(qū)Sdc1mRNA(RealtimePCR)、蛋白(Westernblot)和血清中可溶性Sdc1(ELISA法)表達(dá)水平。 3.2.2.2Sdc1過(guò)表達(dá)對(duì)MI大鼠心室重構(gòu)影響的指標(biāo)：①Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá)比例(天狼星紅染色)和排列情況(透射電鏡)；②Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA水平(RealtimePCR法)；③MI面積、CVF、羥脯氨酸含量、膠原含量和心臟重量。 3.2.2.3Sdc1過(guò)表達(dá)對(duì)MI大鼠心臟功能

13、影響的指標(biāo)：超聲心動(dòng)圖和血流動(dòng)力學(xué)檢查。 3.2.2.4Sdc1作用機(jī)制探討的指標(biāo)：①對(duì)炎癥的影響(HE染色)；②對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響(TUNEL法)；③p38MAPKmRNA(RealtimePCR)和蛋白(Westernblot法)表達(dá)水平。 3.4小結(jié): 3.4.1采用心肌內(nèi)注射法成功在體轉(zhuǎn)染重組腺病毒，使Sdc1在轉(zhuǎn)染后的MI大鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)。 3.4.2MI大鼠心室重量和膠原含量增加，心功能下降，

14、存在心室重構(gòu)。Sdc1過(guò)表達(dá)能減輕心室重量，減少膠原合成，改善心室重構(gòu)和心臟功能，提示Sdc1可能在MI后心室重構(gòu)中具有重要作用。 3.4.3MI大鼠梗死邊緣區(qū)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞大量凋亡；Sdc1過(guò)表達(dá)能減少炎癥細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，提示Sdc1可能通過(guò)影響炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡參與MI后心室重構(gòu)。 3.4.4MI大鼠梗死邊緣區(qū)p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路明顯活化，Sdc1過(guò)表達(dá)能抑制p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路活性，提

15、示Sdc1可能通過(guò)p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路起作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 全文結(jié)論 4.1MI大鼠梗死邊緣區(qū)Sdc1mRNA和蛋白表達(dá)增加，血清中可溶性Sdc1水平升高，三者均在第3天達(dá)到高峰，此后逐漸下降，呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。MI大鼠血清中可溶性Sdc1水平與梗死邊緣區(qū)心肌組織Sdc1蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)。 4.2采用基因重組技術(shù)和改良的體外連接法，成功構(gòu)建出攜帶大鼠Sdc1基因的重組腺病毒載體。 4.

16、3采用心肌內(nèi)注射法成功在體轉(zhuǎn)染重組腺病毒，使Sdc1在轉(zhuǎn)染后的MI大鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)。 4.4Sdc1過(guò)表達(dá)能抑制MI大鼠梗死邊緣區(qū)膠原合成，改善心室重構(gòu)和心臟功能，提示Sdc1可能在MI后心室重構(gòu)中具有重要作用。 4.5Sdc1過(guò)表達(dá)能抑制MI大鼠梗死邊緣區(qū)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，提示Sdc1可能通過(guò)影響炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡參與MI后心室重構(gòu)。 4.6Sdc1過(guò)表達(dá)能抑制MI大鼠梗死邊緣區(qū)p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性