凍干甲型肝炎減毒活疫苗檢定方法的研究.pdf

1、目的：對凍干甲肝減毒活疫苗毒種與成品檢定中的關(guān)鍵性項目的檢定方法進(jìn)行優(yōu)化。(1)利用單克隆抗體代替常規(guī)的人、猴免疫血清進(jìn)行毒種外源因子檢查及鑒別試驗。(2)利用Labworks凝膠成像分析系統(tǒng)判斷疫苗RT-PCR滴度；建立病毒滴度檢測的RT-PCR-ELISA法、微量免疫熒光法。(3)確定疫苗牛血清白蛋白殘留量檢測最佳方法。 方法：(1)毒種檢定：將單克隆抗體與甲肝病毒進(jìn)行中和試驗，觀察單克隆抗體的中和作用；利用單克隆抗體中和毒種

2、，進(jìn)行外源因子檢查，并應(yīng)用于鑒別試驗。(2)感染性滴度檢測：通過對RT-PCR反應(yīng)液的離子濃度、PH值等條件的優(yōu)化，建立檢測滴度的RT-PCR一步法，利用Labworks凝膠成像分析系統(tǒng)的半定量功能判斷結(jié)果，并與常規(guī)組織培養(yǎng)法比較；將標(biāo)記有生物素的寡核苷酸引物所擴增的疫苗病毒基因產(chǎn)物，與微孔反應(yīng)板上的特異性探針進(jìn)行快速雜交，通過辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素進(jìn)行酶聯(lián)顯色，讀取光密度值(OD值)，判斷結(jié)果，并與常規(guī)組織培養(yǎng)法比較；取適宜稀釋

3、度病毒接種細(xì)胞己成致密單層的96孔培養(yǎng)板，至增殖高峰時直接在板上固定細(xì)胞/病毒系統(tǒng)，用間接免疫熒光法觀察結(jié)果，并與常規(guī)組織培養(yǎng)法比較。(3)牛血清白蛋白殘留量測定：比較疫苗牛血清白蛋白殘留量檢測中反向間接血凝法、酶聯(lián)免疫法的重復(fù)性、精確性。 結(jié)果：(1)此單克隆抗體可中和105CCID50/ml甲肝病毒，將此高效價的單克隆抗體中和毒種后進(jìn)行血吸附及非血吸附外源因子檢查，結(jié)果均為陰性；此單克隆抗體還可用于毒種鑒別試驗。(2)利用L

4、abworks凝膠成像分析系統(tǒng)判斷結(jié)果的RT-PCR一步法，與常規(guī)組織培養(yǎng)法檢測疫苗滴度靈敏度相仿(P＞0.05)；RT-PCR-ELISA法簡便、快速、特異，結(jié)果判斷科學(xué)、客觀，靈敏度與組織培養(yǎng)法相仿(P＞0.05)；微量免疫熒光法比常規(guī)組織培養(yǎng)法可提前1周左右出結(jié)果，重復(fù)性良好，靈敏度與常規(guī)組織培養(yǎng)法相似(P＞0.05)；可用LeicaQwin熒光定量分析系統(tǒng)標(biāo)定化判斷結(jié)果。(3)疫苗牛血清白蛋白殘留量檢測中反向間接血凝法測定結(jié)果不

5、穩(wěn)定，兩批疫苗5次測定結(jié)果的變異系數(shù)CV為39.12％，34.23％；酶聯(lián)免疫法的重復(fù)性、精確性均較佳，CV為2.12％、2.82％，回收率101.73％。 結(jié)論：(1)此高效價的單克隆抗體可代替人、猴免疫血清應(yīng)用于毒種的外源因子檢查及鑒別試驗；(2)利用Labworks凝膠成像分析系統(tǒng)判斷疫苗RT-PCR滴度，在常規(guī)RT-PCR法的基礎(chǔ)上具有更簡便，判斷標(biāo)準(zhǔn)更客觀的優(yōu)點；RT-PCR-ELISA法、微量免疫熒光法具有簡便、靈敏