新型水痘帶狀皰疹病毒減毒辣株-ORF7敲除突變株(rOka△7)及其毒力關(guān)鍵因子ORF7的初步研究.pdf

1、水痘是一種急性、高傳染性的兒童常見呼吸道傳播疾病,由水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)引起。同時(shí)VZV也是導(dǎo)致帶狀皰疹(HZ)的病原體,具有嚴(yán)重的危害性?，F(xiàn)今使用的VZV減毒活疫苗株(vOka)是唯一獲WHO批準(zhǔn)使用的水痘/帶狀皰疹疫苗株,然而有研究顯示,vOka為混合毒株且仍具備感染和潛伏神經(jīng)系統(tǒng)的能力,可能存在較復(fù)雜的安全性隱患。因此,迫切需要發(fā)展新型的可消除長期隱患的水痘疫苗株,而VZV關(guān)鍵

2、毒力因子的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證是開展該研究的核心基礎(chǔ)。本研究在前期發(fā)現(xiàn)VZV ORF7抗原缺失可影響病毒在體外人皮膚中感染的工作基礎(chǔ)上通過建立包括人皮膚、胸腺、背根神經(jīng)節(jié)移植人鼠嵌合模型在內(nèi)的VZV體內(nèi)外感染模型全面系統(tǒng)評價(jià)了ORF7抗原對VZV毒力的影響,為VZV新型減毒株的建立提供重要依據(jù)。
　　 本研究引進(jìn)建立了基于VZV Oka株的細(xì)菌人工染色體BAC系統(tǒng)(DY380重組系統(tǒng)),應(yīng)用該系統(tǒng)構(gòu)建了ORF7全基因敲除的重組VZV毒株(

3、rOka△7)及其ORF7基因再次恢復(fù)毒株(rOka△7R)。體外細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)顯示,上述毒株均可在Mewo細(xì)胞和ARPE-19細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)。由于目前尚無針對VZV ORF7抗原的檢測抗體,本研究表達(dá)并純化了ORF7抗原,免疫小鼠后篩選獲得了11株可特異結(jié)合ORF7抗原的單克隆抗體以及1株兔多抗。同時(shí),應(yīng)用連續(xù)步移的合成肽鑒定獲得了上述單克隆抗體的表位。評價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,其中3G11和8H3單抗可很好地應(yīng)用于ORF7抗原的Western

4、-blotting、免疫熒光檢測。同時(shí),本研究應(yīng)用ORF7單抗在免疫熒光檢測中進(jìn)一步證明了rOka△7中ORF7抗原的成功敲除。
　　 人鼠嵌合小鼠模型是通過在免疫缺陷小鼠上實(shí)現(xiàn)人類組織的移植生長,在建立包括VZV在內(nèi)的重要人類病毒的體內(nèi)感染模型上具有顯著的優(yōu)勢和應(yīng)用價(jià)值,其在模擬真實(shí)性、實(shí)現(xiàn)長期復(fù)制感染上具有突出的綜合優(yōu)勢。本研究即分別建立了人皮膚、胸腺、背根神經(jīng)節(jié)(DRG)移植人鼠嵌合模型,并應(yīng)用小鼠活體成像技術(shù)成功建立了可

5、連續(xù)追蹤VZV感染水平的VZV體內(nèi)感染模型。應(yīng)用建立的人鼠嵌合小鼠感染模型研究發(fā)現(xiàn),相比對照組野生型病毒,rOka△7不能在人皮膚中進(jìn)行感染和復(fù)制,不會(huì)產(chǎn)生皮膚組織病變:同時(shí),rOka△7也不能在人背根神經(jīng)節(jié)DRG中進(jìn)行復(fù)制,不產(chǎn)生神經(jīng)組織病變,原位雜交檢測不能檢測到rOka△7的病毒核酸,同時(shí)其也不能感染體外培養(yǎng)的DRG和誘導(dǎo)神經(jīng)組織細(xì)胞。上述研究證明了,ORF7是一個(gè)新型的VZV皮膚和神經(jīng)感染趨向性因子,ORF7敲除可導(dǎo)致VZV同時(shí)

6、在皮膚和神經(jīng)組織中的減毒。
　　 同時(shí),本研究應(yīng)用人胸腺組織移植人鼠嵌合模型研究發(fā)現(xiàn),rOka△7與未敲除對照病毒均可在人胸腺組織中復(fù)制。對分離的人樹突狀淋巴細(xì)胞(DC)的感染實(shí)驗(yàn)顯示,rOka△7與對照病毒均可感染人DC細(xì)胞。這說明,VZV在人T細(xì)胞中的感染和復(fù)制不依賴于ORF7抗原。由于人淋巴組織的感染是人體對VZV減毒疫苗產(chǎn)生免疫反應(yīng)的重要組織,rOka△7可感染人T細(xì)胞有利于VZV作為免疫原被包括人DC細(xì)胞在內(nèi)的淋巴細(xì)胞

7、識(shí)別及呈遞。上述研究顯示了,rOka△7有望成為一種新型皮膚神經(jīng)減毒候選疫苗。
　　 本研究也初步探索了ORF7的可能作用機(jī)制。免疫檢測顯示,ORF7主要存在于VZV感染后細(xì)胞的高爾基體(TGN),也存在于VZV病毒粒子中。同時(shí)研究顯示,ORF7敲除會(huì)在.ARPE-19細(xì)胞中影響VZV感染導(dǎo)致的合胞體形成,這表明合胞體的形成可能不僅需要病毒糖蛋白也需要ORF7。
　　 綜上所述,本研究通過建立并應(yīng)用包括人皮膚、胸腺、背根