新型水痘帶狀皰疹病毒減毒辣株-ORF7敲除突變株(rOka△7)及其毒力關(guān)鍵因子ORF7的初步研究.pdf

1、水痘是一種急性、高傳染性的兒童常見呼吸道傳播疾病,由水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)引起。同時VZV也是導致帶狀皰疹(HZ)的病原體,具有嚴重的危害性?，F(xiàn)今使用的VZV減毒活疫苗株(vOka)是唯一獲WHO批準使用的水痘/帶狀皰疹疫苗株,然而有研究顯示,vOka為混合毒株且仍具備感染和潛伏神經(jīng)系統(tǒng)的能力,可能存在較復雜的安全性隱患。因此,迫切需要發(fā)展新型的可消除長期隱患的水痘疫苗株,而VZV關(guān)鍵

2、毒力因子的發(fā)現(xiàn)和驗證是開展該研究的核心基礎。本研究在前期發(fā)現(xiàn)VZV ORF7抗原缺失可影響病毒在體外人皮膚中感染的工作基礎上通過建立包括人皮膚、胸腺、背根神經(jīng)節(jié)移植人鼠嵌合模型在內(nèi)的VZV體內(nèi)外感染模型全面系統(tǒng)評價了ORF7抗原對VZV毒力的影響,為VZV新型減毒株的建立提供重要依據(jù)。
　　 本研究引進建立了基于VZV Oka株的細菌人工染色體BAC系統(tǒng)(DY380重組系統(tǒng)),應用該系統(tǒng)構(gòu)建了ORF7全基因敲除的重組VZV毒株(

3、rOka△7)及其ORF7基因再次恢復毒株(rOka△7R)。體外細胞感染實驗顯示,上述毒株均可在Mewo細胞和ARPE-19細胞中進行培養(yǎng)。由于目前尚無針對VZV ORF7抗原的檢測抗體,本研究表達并純化了ORF7抗原,免疫小鼠后篩選獲得了11株可特異結(jié)合ORF7抗原的單克隆抗體以及1株兔多抗。同時,應用連續(xù)步移的合成肽鑒定獲得了上述單克隆抗體的表位。評價實驗結(jié)果顯示,其中3G11和8H3單抗可很好地應用于ORF7抗原的Western

4、-blotting、免疫熒光檢測。同時,本研究應用ORF7單抗在免疫熒光檢測中進一步證明了rOka△7中ORF7抗原的成功敲除。
　　 人鼠嵌合小鼠模型是通過在免疫缺陷小鼠上實現(xiàn)人類組織的移植生長,在建立包括VZV在內(nèi)的重要人類病毒的體內(nèi)感染模型上具有顯著的優(yōu)勢和應用價值,其在模擬真實性、實現(xiàn)長期復制感染上具有突出的綜合優(yōu)勢。本研究即分別建立了人皮膚、胸腺、背根神經(jīng)節(jié)(DRG)移植人鼠嵌合模型,并應用小鼠活體成像技術(shù)成功建立了可

5、連續(xù)追蹤VZV感染水平的VZV體內(nèi)感染模型。應用建立的人鼠嵌合小鼠感染模型研究發(fā)現(xiàn),相比對照組野生型病毒,rOka△7不能在人皮膚中進行感染和復制,不會產(chǎn)生皮膚組織病變:同時,rOka△7也不能在人背根神經(jīng)節(jié)DRG中進行復制,不產(chǎn)生神經(jīng)組織病變,原位雜交檢測不能檢測到rOka△7的病毒核酸,同時其也不能感染體外培養(yǎng)的DRG和誘導神經(jīng)組織細胞。上述研究證明了,ORF7是一個新型的VZV皮膚和神經(jīng)感染趨向性因子,ORF7敲除可導致VZV同時

6、在皮膚和神經(jīng)組織中的減毒。
　　 同時,本研究應用人胸腺組織移植人鼠嵌合模型研究發(fā)現(xiàn),rOka△7與未敲除對照病毒均可在人胸腺組織中復制。對分離的人樹突狀淋巴細胞(DC)的感染實驗顯示,rOka△7與對照病毒均可感染人DC細胞。這說明,VZV在人T細胞中的感染和復制不依賴于ORF7抗原。由于人淋巴組織的感染是人體對VZV減毒疫苗產(chǎn)生免疫反應的重要組織,rOka△7可感染人T細胞有利于VZV作為免疫原被包括人DC細胞在內(nèi)的淋巴細胞

7、識別及呈遞。上述研究顯示了,rOka△7有望成為一種新型皮膚神經(jīng)減毒候選疫苗。
　　 本研究也初步探索了ORF7的可能作用機制。免疫檢測顯示,ORF7主要存在于VZV感染后細胞的高爾基體(TGN),也存在于VZV病毒粒子中。同時研究顯示,ORF7敲除會在.ARPE-19細胞中影響VZV感染導致的合胞體形成,這表明合胞體的形成可能不僅需要病毒糖蛋白也需要ORF7。
　　 綜上所述,本研究通過建立并應用包括人皮膚、胸腺、背根