水痘-帶狀皰疹病毒新型減毒疫苗株V-7D與ORF7蛋白功能研究.pdf

1、水痘-帶狀皰疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）是一種全球性普遍存在的對神經(jīng)系統(tǒng)具有高度趨向性的人類皰疹病毒，主要引發(fā)兩種不同臨床表現(xiàn)的疾病:初次感染可引發(fā)水痘（varicella or chickenpox），長期潛伏再激活后可引發(fā)帶狀皰疹（herpeszoster or shingles）。水痘是一種具有高度傳染性的兒童常見皮膚疾病，帶狀皰疹則多發(fā)于中老年人以及免疫妥協(xié)或缺陷的病人，并隨著年齡增大而發(fā)病率顯

2、著增加，具有嚴重的危害性。目前仍缺乏水痘和帶狀皰疹的特效治療藥物，接種疫苗是預防水痘和帶狀皰疹的最經(jīng)濟有效的措施。vOka株是目前使用的水痘/帶狀皰疹減毒活疫苗株，但研究已顯示，vOka株雖然可在人皮膚中減毒，但仍具有感染和潛伏人神經(jīng)系統(tǒng)的能力，其安全隱患不容忽視。因此，開發(fā)新型的更為安全有效的水痘-帶狀皰疹疫苗已成為當前的迫切需求。在前期研究中，我們與合作實驗室應用反向遺傳學技術首次發(fā)現(xiàn)VZV體外復制的非必需基因orf7是VZV體內(nèi)感

3、染人皮膚和背根神經(jīng)節(jié)組織的雙嗜性決定因子，同時ORF7敲除的VZV毒株可在人T細胞和樹突狀細胞中擴增。這提示了ORF7表達缺失VZV毒株具有發(fā)展為新型水痘-帶狀皰疹減毒活疫苗候選株的潛力。本研究即在此基礎上，探索構建ORF7缺失的新型VZV候選疫苗株，并開展病毒學、毒力和免疫原性等研究，分析其發(fā)展為新型水痘-帶狀皰疹疫苗的可行性，同時進一步對ORF7的功能以及ORF7表達缺失的減毒機制進行探索，為VZV的防治方法研究提供基礎。
　

4、　本研究首先應用反向遺傳學方法構建了不包含報告基因等非病毒株來源基因序列的新型ORF7表達缺陷減毒株V-7D，通過PCR鑒定、基因測序、蛋白印跡法檢測等方法驗證構建的V-7D的ORF7抗原表達缺陷，符合預期設計。MRC-5細胞是一種人胚肺成纖維二倍體細胞，已被較廣泛應用于包括現(xiàn)有水痘疫苗在內(nèi)的多種人用疫苗的制備。本研究評價了V-7D在MRC-5細胞中的培養(yǎng)特性。結果顯示，V-7D可以在MRC-5細胞中高效復制，其效價與vOka株相當。本

5、研究進一步應用透射電鏡對V-7D與原型毒株pOka感染后的MRC-5細胞進行觀測。結果顯示，V-7D與pOka在感染MRC-5細胞中的病毒顆粒數(shù)量、分布及超微結構均無明顯差別。同時，本研究應用蔗糖密度梯度離心與蛋白印跡法分別分析了V-7D、vOka與pOka在感染后MRC-5細胞的裂解上清（疫苗主要成分）中的主要病毒抗原的差異。結果顯示，除V-7D組不能檢測到ORF7抗原外，V-7D、vOka與pOka組在其它包括病毒糖蛋白、衣殼蛋白以

6、及典型皮層蛋白在內(nèi)的主要病毒抗原的含量與分布均未見明顯差異。上述結果說明，本研究成功構建了ORF7表達缺陷的新型VZV候選疫苗株V-7D，其可在人二倍體細胞株MRC-5中高效增殖;ORF7的表達缺陷并不會顯著影響VZV在MRC-5細胞中的組裝，以及細胞裂解上清病毒主要抗原的含量與分布。
　　為驗證V-7D對人類VZV易感組織的感染能力，本研究構建了人胸腺、皮膚、背根神經(jīng)節(jié)移植的SCID-hu人鼠嵌合模型，并應用上述模型開展相關實驗

7、。通過將不同毒株分別感染人皮膚、背根神經(jīng)節(jié)移植的嵌合模型小鼠，在感染后不同時間點應用PCR、免疫組織化學等方法進行檢測。結果顯示，本研究構建ORF7表達缺陷的V-7D株無法有效感染人皮膚和背根神經(jīng)節(jié)組織，而原型對照毒株pOka則可高效感染人皮膚和背根神經(jīng)節(jié)組織。為更好地驗證ORF7缺陷對VZV毒力的影響，本研究首次在SCID-hu人鼠嵌合模型中模擬了VZV天然感染的過程。結果顯示，VZV-7D與對照VZV-ROka株均可以經(jīng)樹突狀細胞感

8、染人胸腺組織T細胞;隨后分離出感染后的人胸腺T細胞并靜脈接種人皮膚嵌合模型小鼠，其中VZV-ROka可通過T細胞介導成功感染人皮膚組織，而VZV-7D無法通過感染T細胞的介導再感染嵌合模型小鼠的人皮膚組織。上述結果說明，ORF7表達缺失的VZV毒株具有發(fā)展成為新型水痘或帶狀皰疹疫苗所必需的安全性特征。
　　本研究進一步對V-7D的免疫原性進行研究。應用與vOka株相同的方法制備V-7D疫苗原液，再將V-7D與vOka以相同劑量分別

9、對大鼠和豚鼠進行免疫，評價其激活體液與細胞免疫反應的水平。在體液免疫反應方面，應用gpELISA和膜抗原熒光抗體實驗方法檢測結果顯示，V-7D和vOka免疫后動物血清中的VZV抗體滴度均顯著升高，二者激活體液免疫反應的水平相當。在細胞免疫反應方面，V-7D和vOka免疫后大鼠的脾細胞經(jīng)相應病毒刺激分泌的IFN-γ水平與陰性對照組相比均顯著提高，其反應水平亦基本相當。同時，本研究應用SCID-hu人鼠嵌合模型研究了V-7D與VZV-pOk

10、a接種人皮膚和胸腺組織后激活固有免疫反應的情況。結果顯示，V-7D和pOka接種人皮膚后都能在短時間內(nèi)顯著提高組織促炎癥細胞因子的分泌水平，其中pOka因為能夠感染其激活的固有免疫反應持續(xù)時間長，V-7D則因為無法感染其激活的固有免疫反應會逐漸恢復到陰性水平;另一方面，人T細胞對V-7D和pOka感染的固有免疫反應較低，甚至出現(xiàn)固有免疫能力下降的趨勢。上述結果說明，V-7D具有與vOka株相當?shù)拿庖咴裕捎行Ъせ顧C體的體液免疫、細胞免

11、疫以及固有免疫反應，具有發(fā)展為新型疫苗的良好潛力。
　　本研究進一步對ORF7的功能和作用機制進行探索，主要包括ORF7蛋白性質(zhì)鑒定、ORF7相關蛋白-蛋白相互作用和ORF7功能域分析研究。(1)在ORF7的蛋白性質(zhì)方面，本研究首次通過實驗證據(jù)證明了ORF7屬于VZV皮層蛋白，并且ORF7包裝進入病毒顆粒皮層依賴于其高爾基體定位，而ORF7的高爾基體定位又依賴于ORF7 N端保守的第9位保守半胱氨酸以及VZV未知功能蛋白的調(diào)控。另

12、外，本研究還鑒定出ORF7屬于磷酸化蛋白，其中（病毒感染或細胞轉(zhuǎn)染）真核表達的ORF7具有絲氨酸和酪氨酸的磷酸化修飾，而原核表達ORF7僅具有酪氨酸磷酸化修飾;在體外激酶實驗中，原核表達ORF7能夠被病毒蛋白激酶ORF47絲氨酸磷酸化，因此ORF7屬于ORF47激酶底物。本研究通過軟件預測獲得多個ORF7潛在磷酸化位點，其中ORF7 N端20-23 aa的“SYEE”序列中包含了ORF47底物磷酸化的共有序列及保守的酪氨酸位點。通過對該

13、序列的點突變分析發(fā)現(xiàn)，ORF7第20位絲氨酸突變不影響其整體絲氨酸磷酸化水平，但是ORF7第21位保守酪氨酸突變后其酪氨酸磷酸化水平明顯減弱。(2)在ORF7相關蛋白-蛋白相互作用研究方面，本研究制備了針對VZV25種主要結構蛋白的多抗血清或單克隆抗體，并與前期研究獲得的VZV抗體組成可用于檢測VZV33種重要抗原的抗體庫。接著，本研究應用免疫共沉淀的方法從VZV-ROka感染的ARPE-19細胞中篩選出與ORF7相互作用的10種病毒蛋

14、白，應用試劑盒從7390種人源性蛋白庫中篩選出與ORF7相互作用的66種宿主細胞蛋白。隨后，本研究應用293T細胞轉(zhuǎn)染的真核表達實驗，確認了ORF7與ORF47和GRASP65存在直接相互作用，但與ORF9沒有直接相互作用。最后，本研究在VZV-ROka和VZV-7D感染的ARPE-19細胞中觀察到與ORF7相互作用的4種VZV蛋白的亞細胞定位及其與細胞骨架相互作用在ORF7敲除后出現(xiàn)異常。(3)在ORF7功能域分析方面，本研究確定了O

15、RF7 N端序列存在影響VZV體外與體內(nèi)毒力的關鍵功能域，而ORF7至少66 aa到C端的全部氨基酸序列對VZV的毒力無任何影響。另一方面，突變ORF7 N端高爾基體定位信號后雖影響了ORF7在病毒皮層內(nèi)的包裝以及VZV在體外細胞上的毒力，但是卻不影響病毒在體內(nèi)人皮膚和DRG組織中的毒力，該結果提示了ORF7 N端存在影響VZV毒力的不同功能域。
　　綜上所述，本研究獲得了具有良好成苗性、安全性和免疫原性特征的新型減毒疫苗株V-7